[发明专利]基因拷贝数定量分析

权利要求书

1.检测目的基因拷贝数的方法，包括：

a)设计所述目的基因的扩增和延伸引物、所述目的基因的竞争物、不存在拷贝数变异的内参基因的扩增和延伸引物，和所述内参基因的竞争物，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述目的基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，作为与所述目的基因的竞争性扩增模板在PCR扩增反应中同时扩增，所述目的基因的延伸引物在延伸反应中能够分别延伸所述目的基因和目的基因的竞争物的扩增产物；所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在至少1个核苷酸的差异并且与所述内参基因具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，作为所述内参基因的竞争性扩增模板在PCR扩增反应中同时扩增，所述内参基因的延伸引物能够在延伸反应中分别延伸所述内参基因和内参基因的竞争物的扩增产物；

b)在获自怀疑具有目的基因拷贝数变异的受试者的待测DNA样本和获自正常人的正常对照DNA样本中加入步骤a)所述的扩增引物，进行PCR扩增，得到目的基因、内参基因及其各自竞争物的PCR扩增产物；

c)在所述PCR扩增产物中加入步骤a)所述的延伸引物，进行延伸反应，得到目的基因、内参基因及其各自竞争物的延伸产物；

d)对所述延伸产物进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，并且将得到的各个延伸产物的数据进行以下分析：

i)样本内校正：计算待测样本中目的基因的校正用比值，即，内参基因/内参基因竞争物的比值，并且获得目的基因/目的基因竞争物的比值；用目的基因/目的基因竞争物的比值除以校正用比值，得到目的基因的初校后比值，即：目的基因与目的基因竞争物的比值/内参基因与内参基因竞争物的比值；

ii)样本间校正：按照步骤i)的方法，计算正常对照样本中目的基因的初校后比值；将步骤i)中获取的待测样本中的目的基因初校后比值与正常对照样本中相应的目的基因初校后比值相比，获得目的基因的终校后比值，即目的基因初校后比值_待测样本/目的基因初校后比值_{正常参考样本}；

iii)用待测样本目的基因终校后比值乘以2，得到待测样本中目的基因的拷贝数。

2.权利要求1的方法，其中所述DNA样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。

3.权利要求1或2的方法，其中所述目的基因是SMN1、SMN2、NAIP、HBA1、HBA2和/或HBQ基因。

4.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述目的基因的竞争物与所述目的基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异，并且所述内参基因的竞争物与所述内参基因存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的差异。

5.权利要求3的方法，其中所述目的基因的扩增和延伸引物选自i)SMN1 7号外显子和SMN2 7号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：6所示；ii)SMN18号外显子和SMN2 8号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：5所示；iii)NAIP基因5号外显子的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：13-14和SEQ IDNO：15所示；iv)HBA1基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：17-18和SEQ ID NO：24所示；v)HBA2基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：19-20和SEQ ID NO：26所示；vi)HBQ基因的扩增和延伸引物，其分别如SEQ ID NO：21-22和SEQ ID NO：28所示。