[发明专利]基因拷贝数定量分析

说明书

本发明涉及基因拷贝数定量分析。本发明通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术平台结合单碱基延伸反应和竞争PCR技术检测，后续通过多步校正完成对基因拷贝数的准确定量。本发明还涉及用于执行上述方法的试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体涉及基因拷贝数的定量分析。

背景技术

基因拷贝数异常(copy number variations，CNV)是广泛存在于人类基因组的一种结构变异。基因拷贝数异常最早在病人的基因组中发现，如遗传性疾病患者、肿瘤患者；但后续的研究发现基因拷贝数异常在正常的个体中也广泛存在。虽然拷贝数异常发生的频率相对较低，但拷贝数异常的片段大小从1kb到数个Mb不等，其累及的基因序列长度相对较长，与人类的健康和疾病的有着密切关联。已有研究证明诸多基因拷贝数异常与疾病的发病、疾病表型存在着密切联系。基因拷贝数异常的检测对于疾病的诊断治疗，尤其是某些遗传性疾病(例如脊髓型肌萎缩症及α-地中海贫血)的诊断治疗及其重要。

脊髓性肌萎缩症是婴幼儿致死的主要遗传疾病之一，是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，表现为脊髓运动神经元变性，骨骼肌萎缩和全身无力。脊髓性肌萎缩症在中的发病率为1/6000-1/10000，全球不同人群携带者频率为1/40-1/50。

SMN基因(survival motor neuron gene)的检测是脊髓性肌萎缩症临床诊断的关键手段。95％的脊髓性肌萎缩患者是由于位于5号染色体长臂的SMN1基因纯合缺失或杂合缺失伴点突变，无法生成功能性的SMN蛋白，致脊髓运动神经元变性，称为5qSMA。这其中，90～95％的患者为SMN1基因纯合缺失，另有5％～10％左右的患者为SMN1杂合缺失伴点突变型即复合杂合型。此外在SMN1基因所在区域附近有一与之高度同源的基因SMN2(相似度高达99％，极难分辨)，在外显子区域仅存在2个位点的差异(7号外显子840C＞T，8号外显子1239G＞A)，在内含子区域有十数个位点的差异。由于SMN1与SMN2外显子7上的840C＞T的位点差异使得SMN2在转录生成mRNA时发生外显子跳跃，无法正确剪接，仅有10％左右的SMN2的转录产物为全长能翻译成功能性的SMN蛋白。有相关研究表明SMN2拷贝数与脊髓性肌萎缩症患者的表型相关，且当下已上市的治疗脊髓性肌萎缩症的nusinersen是基于修正SMN2mRNA的正确剪接，从而生成更多的功能性SMN蛋白起到治疗作用。因此，SMN基因主要检测内容包括：SMN1基因缺失检测、SMN2基因拷贝数检测、SMN1基因致病性点突变的检测。

α-地中海贫血是由于α珠蛋白基因(HBA基因)发生突变导致α肽链合成减少或无法合成，导致血红蛋白的组成成份改变，继而引发慢性溶血和贫血。HBA基因包括两个同源基因HBA1及HBA2，正常人中各2拷贝。HBA1基因和HBA2基因HBA基因缺陷包括HBA1和HBA2的基因缺失或致病性点突变。约80-90％的HBA基因缺陷人群是由于HBA1或HBA2的部分缺失或全缺失导致，10％-20％的HBA基因缺陷人群是由于HBA1或HBA2基因的致病性点突变导致。HBA基因缺陷人群是否发病及疾病的严重程度与与其受累HBA基因的拷贝数相关。此外，由于在这两个基因所在区域存在其他与之同源的相似序列，这对HBA1及HBA2的拷贝数定量造成了一定困难。

鉴于基因拷贝数检测对于疾病诊断及研究的重要意义，如何准确的定量基因拷贝数是首要解决的问题。目前常用于基因拷贝数检测的方法主要包括：多重连接探针检测(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，实时荧光定量PCR(qPCR)等。