[发明专利]一种优化后的猪圆环病毒3型衣壳蛋白基因及其在制备病毒样颗粒中的应用

说明书

本发明公开了一种优化后的猪圆环病毒3型衣壳蛋白基因及其在制备病毒样颗粒中的应用。本发明经优化后的猪圆环病毒3型衣壳蛋白全长基因如SEQ ID NO.1所示，该序列是针对大肠杆菌表达系统进行的部分优化。与密码子全部优化或不优化相比，该序列能够高水平表达重组蛋白，并能够组装成完整的病毒样颗粒。本发明还公开了制备病毒样颗粒的方法，涉及猪圆环病毒3型衣壳蛋白基因的优化、基因的克隆及其在大肠杆菌中表达，以及重组蛋白的纯化及病毒样颗粒的制备。本发明简单易行，成本较低，实现了猪圆环病毒3型衣壳蛋白在大肠杆菌中稳定表达，表达的重组衣壳蛋白可自组装形成病毒样颗粒，为猪圆环病毒3型的抗体检测及亚单位疫苗的研制提供了技术手段。

技术领域

本发明涉及一种优化后的猪圆环病毒3型衣壳蛋白基因，还涉及该基因在制备病毒样颗粒中的应用。本发明属于动物基因工程与动物病毒学技术领域。

背景技术

2015年6月,美国北卡罗来纳州一个商品猪场母猪群暴发皮炎肾病综合征(PDNS)，发病期间，该场母猪死亡率较历史平均水平增加了10.2％，受胎率减少了0.6％，窝均木乃伊胎相比历史平均水平增加1.19％，流产出的木乃伊胎大小不一。临床上，感染母猪厌食，皮肤多处出现丘疹性皮炎；组织结构上观察，皮肤损伤以急性坏死性皮炎为特点；肾皮质区肾小管扩张，管状黏膜上皮细胞退化，肾皮质间质及肾小球大量淋巴细胞及巨噬细胞弥漫性浸润。死亡母猪表现出皮炎肾病综合征(PDNS)。以上关于母猪眼观病变以及组织学病变，包括流产症状，都与以前报道的圆环病毒相关疾病基本一致。然而所有母猪组织样本，包括肾脏、淋巴结、肺脏以及皮肤组织样本，经免疫组化(IHC)检测以及定量PCR(qPCR)检测发现PCV2，PRRSV，IAV均为阴性，此外，木乃伊胎组织定量PCR检测显示PCV2，PRRSV，PPV同样都为阴性。在针对样本采用宏基因组测序后，发现一种新型，基因型不同以往的圆环病毒，命名为PCV3。与PCV1和PCV2一样，PCV3病毒包含2个主要开放阅读框(ORF)。其中，ORF1编码由297个氨基酸(aa)组成复制酶蛋白Rep，ORF2编码由214个aa组成衣壳蛋白Cap，两者复制方向相反。PCV3阳性地区已经分布于世界各地，我国的34个省份有21个省份有PCV3阳性报道。可以预想，PCV3会对养猪业造成很大的损失。因此，提出对于PCV3有效的防控措施极其重要。然而PCV3具有极难在体外分离培养的特点，这对疫苗的研究造成极大的困难。

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLP)是利用重组表达的方法，在体外将重组病毒衣壳蛋白自组装成与天然病毒有相似结构的空心颗粒。VLP是制备病毒疫苗较为理想的重组蛋白抗原，它具备如下优点:①不含病毒核酸，无减毒病毒疫苗(Live attenuatedvirus vaccine)或灭活病毒疫苗(Inactivated virus vaccine)的感染风险；②与天然病毒的外部结构高度相似因而具有与病毒颗粒相近的免疫原性；③具有病原体相关模式分子(Pathogen-associated molecular patterns，PANP)的活性，可激活固有免疫应答；④其形态和大小有利于抗原提呈细胞特别是树突细胞的摄取；⑤可经MHC I类和II类分子提呈，激活CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞；⑥能激活B细胞产生高滴度的抗体，也能激发T细胞非依赖的IgM反应；⑦可用于递送Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂和T细胞表位；⑧本身可有佐剂功能；⑨作为VLP呈现平台(VLP display platforms)呈现其他抗原。因此，构建猪圆环病毒3型的病毒样颗粒可能为解决该病毒的广泛流行提供一个新的方向。