[发明专利]一种表征RNA甲基化修饰的方法及应用

说明书

本发明提供了一种表征RNA甲基化修饰的方法及应用，所述方法包括将RNA样本置于石英板中，采用紫外吸收光谱法和/或荧光光谱法进行RNA样本特征峰的检测，本发明针对RNA的m6A甲基化修饰通路，应用理论计算方法获取RNA序列与RNA m6A甲基化序列的特征吸收光谱，建立了基于光谱法的RNA甲基化动态修饰的表征方法，所述方法通过特征吸收峰的迁移实现了对mRNA m6A甲基化/去甲基化的鉴别，同时实现了在RNA甲基化修饰酶Mettl3/Mettl14/WTAP的作用下，RNA甲基化修饰的变温定量分析，所述方法在评价和筛选RNA甲基化修饰酶的抑制剂以及相关疾病治疗药物的研制方面具有应用前景。

技术领域

本发明属于表观转录组学技术领域，涉及一种表征RNA甲基化修饰的方法及应用。

背景技术

近年来，可逆性甲基化RNA N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)受到越来越广泛的关注，研究人员陆续定位了哺乳动物转录组中的m6A，鉴定了执行这种动态修饰的“读”、“写”和“擦除”功能蛋白，并逐步解析了m6A在转录后调控中的功能。研究发现，在表观转录组中，m6A是真核生物中最常见和最丰富的mRNA分子修饰，对m6A进行功能研究拓展了人类对疾病过程的认识。Mettl3/Mettl14/WTAP甲基转移酶复合体催化m6A修饰，FTO和ALKBH5去甲基化酶对m6A进行去甲基化，m6A的修饰酶和结合蛋白YTHDF1、YTHDF2与YTHDC1用于识别m6A，证明RNA甲基化修饰是一个动态可逆的过程，这一动态可逆的表观转录组在多种生物过程中起到了重要作用。该过程不仅建立了正常的细胞表型，而且还可能导致疾病的发生。例如，Kharas MG等发现，在人造血干/祖细胞(HSPC)中，通过shRNA介导消耗的m6A修饰酶mettl3，可以促进细胞分化并减少细胞增殖；相反，过表达不具有催化活性的野生型mettl3，可以抑制细胞分化并促进细胞的生长。随着对m6A在转录后调控中功能的深入研究，RNA甲基化与去甲基化的动态修饰过程与多种疾病的发生发展密切相关。

表观遗传调控的动态特征意味着：在直接放大与疾病相关过程的分子因素时，使改变疾病相关的表观遗传状态成为可能。RNA甲基化修饰是动态可逆的，对于基于m6A调控蛋白的药物研发和基于m6A调控的临床治疗转化应用都具有深远意义。在有关m6A水平与疾病发生关系的基础研究和应用研究中，都需要对m6A甲基化修饰动态水平进行高效灵敏的定量检测。目前，针对m6A修饰的研究主要围绕功能展开，处于分子水平、细胞水平和在体动物(多为小鼠或大鼠)水平，通常采用PCR扩增、Western-blot、基因敲除或突变、分子重组表达等细胞生物学和分子生物学手段，这些方法在鉴别RNA甲基化与去甲基化时过程繁琐，不易操作。

CN 105018617A公开了单个基因mRNA甲基化水平检测方法，包括以下步骤：1)、设计靶基因甲基化区域的荧光定量引物；2)、提取总RNA，用化学断裂法将总RNA片段化为RNA片段；3)、将步骤2)得到的片段化的RNA通过特异性识别m6A的抗体将带有m6A位点的所有mRNA片段沉淀下来，并用琼脂糖磁珠进行收集富集；4)、将步骤3)中抗体富集得到的mRNA片段反转录，用步骤1)的荧光定量PCR引物进行实时荧光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相对表达量，相对表达量的高低就代表了单个基因mRNA甲基化水平高低。所述方法基于荧光定量PCR，过程繁琐。

CN 106047997 A公开了mRNA甲基化高通量检测方法，包括以下步骤：mRNA样品提取；将提取的RNA样品进行片段化；将得到的RNA片段利用特异性识别mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗体进行免疫富集；将富集后含有m6A的mRNA片段洗脱后进行沉淀纯化；将所得纯化后的RNA反转录成cDNA，并进行DNA末端修复、接头连接和PCR扩增，完成mRNA甲基化文库的构建；将完成的文库利用分析测序文库的高通量测序平台进行测序。所述方法经过免疫富集、沉淀纯化、反转录和PCR扩增等多个步骤，操作复杂。

目前，应用于RNA表观修饰的高效灵敏方法在国内外还处于空白。

发明内容