[发明专利]一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的序列，其中：

SEQ ID NO：1：gtacttccattcgacctctgtaacagccacgaaaaccctatatcaaaagtg；

SEQ ID No：2：ggaccagttgtctttcggtctctaccccagcccgt

SEQ ID No：3：cctacgaaccactgaacacgggctggggtagagaccgaaaga

ca actggtccagccgttcctcacaccagacagtgggggaaagc

SEQ ID No：4：gttcagtggttcgtagggctttcccccact

SEQ ID No：5：tggtctatctggaagaat

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为H1N1流感病毒的核酸适体序列1和2，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ ID NO：5为RCA反应体系引物2。

2.根据权利要求1所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：H1N1流感病毒的核酸适体：序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2分别采用H1N1完整病毒颗粒和B型流感病毒颗粒进行点杂交实验进行验证。

3.根据权利要求1所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述H1N1流感病毒的核酸适体1，采用磁珠-多价适体1结合的方式。

4.根据权利要求3所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述磁珠-多价适体1捕获H1N1流感病毒的缓冲液组分为0.5M NaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。

5.根据权利要求3所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述磁珠-多价适体1-H1N1流感病毒复合物结合适体2的缓冲液组分为0.5MNaCl、20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5。

6.一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒的反应体系，所述反应体系每50μL中包括：

7.一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒检测方法，包括如下步骤：

1)提供SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示的序列；其中SEQ ID NO：1为H1N1流感病毒的核酸适体1序列,SEQ ID NO：2为H1N1流感病毒的核酸适体2序列，SEQ ID NO：3为成环反应序列，SEQ ID NO：4为环互补序列，SEQ ID NO：5为RCA反应体系引物2。

2)制备磁珠-多价适体1复合物；

3)磁珠-多价适体1捕获流感病毒；

3)被捕获的流感病毒结合适体2

4)锁式法制备DNA环；

5)DA-RCA法对H1N1流感病毒检测。

8.如权利要求7所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒检测方法，其特征在于：

步骤4)中，所述成环反应步骤为加入0.5μL SEQ ID NO：3和0.5μL SEQ ID NO：4所示的序列，缓冲液组分为20mM Tris-HCL和1mM EDTA，缓冲液pH＝7.5，15μL ddH₂O于PCR管中；95℃反应4～6min,37℃放置12～18min,加入3μL 10×T4 DNA ligase buffer、1μL 400U/μLT4 DNA连接酶,置25℃反应2h；反应结束后加入EXO I外切酶0.8μL，EXO III外切酶0.4μL，于37℃反应1h后85℃灭活20min，备用。

9.如权利要求7所述的一种基于双适体RCA技术快速诊断H1N1流感病毒检测方法，其特征在于：步骤5)中，在步骤4)反应之后，加入10umol/L引物2即序列SEQ ID No：5，0.5μL于PCR管中，随后加入dNTPs(10mM)4μL，MgSO4(100mM)1.5μL，10×Thermopol buffer 2.5μL，与8U Bst DNA聚合酶大片段0.5μL，羟基萘酚蓝(HNB)指示剂(4.5mM)1μL，ddH20补齐至50μL，65℃反应1h，观察颜色反应。