[发明专利]基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法

说明书

本发明公开了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法，包括以下步骤：DNA正四面体探针金电极的合成；将AFB1‑HRP抗原分别与金电极孵育；然后将孵育后的金电极与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号获得标准曲线；将待测样品、AFB1‑HRP与金电极孵育，然后与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号；通过聚苯胺的电化学信号对应于标准曲线得出AFB1的浓度。本发明利用DNA正四面体的刚性结构，将黄曲霉毒素B1鼠单抗有序组装在金电极表面，有效提高了抗原抗体专一性识别结合效率；相比传统的单链DNA或者11‑巯基十一烷酸等小分子探针，电化学信号明显增强，方法灵敏度提升1~2个数量级。

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法。

背景技术

真菌毒素是指真菌生长繁殖过程中产生的次级代谢产物，其种类繁多，现已被分离鉴定的有400余种，主要包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮/醇等。真菌毒素一般都是相对分子质量小的物质，通常不被粮食谷物加工工艺或食品的烹调加热所破坏，所以在某种程度上比其他毒素如细菌毒素更危险。真菌毒素的社会危害极大，主要以黄曲霉毒素AFB1危害最大，同时也是危害中国少年儿童身体健康的主要原因，具有高致癌性。目前，国内谷物产品存在规模小、分散、晾晒方法不科学等问题，且AFB1检测产品良莠不齐，其影响了食品生产企业的自检和监管机构的监测效果。AFB1快检产品没有完全实现本土化，国外产品的垄断地位虽然已被打破，但依然占据很大的市场。为了阻止AFB1带来的食品安全问题和减少经济损失，开发AFB1快速、灵敏的检测方法显得尤其重要。

目前，我国绝大多数检测机构所采用的AFB1的检测方法主要分为三类：一类是生物学检测法，包括种子发芽试验、呕吐试验等，很不利于快速检测，已很少采用；一类是理化检测法，薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC虽然简便，但检出限高、灵敏度差，只能作半定量。HPLC虽然灵敏度高，但样品处理步骤烦琐、操作复杂、仪器设备要求高、标准品耗用大；另一类是免疫化学检测法，如ELISA方法和胶体金免疫层析方法。ELISA法特别适宜大批样品集中检测，胶体金免疫层析方法适合现场单个或少数样品即时检测，但是若样品前处理不当，极易导致假阳性的出现。荷兰EuroProxima公司、美国Beacon公司、北京望尔生物技术有限公司、杭州迪恩生物科技股份有限公司开发的基于酶联免疫试剂盒快检的假阳性率普遍较高。

因此开发一种简单、快速、准确检测谷物中的黄曲霉毒素AFB1新方法对于控制食品安全发生具有重要意义！

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于谷物中AFB1的检测方法。本发明中针对苯胺聚合在正四面体探针表面后电化学性质发生明显变化，从而建立竞争法检测AFB1，其原理简单、可以达到高效快检，并实现检测仪器的小型化。本发明通过一种基于金电极表面功能化修饰单克隆抗体形成DNA正四面体探针，特异性识别AFB1-HRP抗原，然后催化苯胺原位沉积，竞争法检测AFB1。本发明利用DNA正四面体探针、苯胺沉积性质以及抗原抗体特异性识别性质，实现竞争法检测AFB1。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于HRP催化聚苯胺原位生成用于AFB1的检测方法，包括以下步骤：

1)DNA正四面体探针金电极的合成；

2)将已知不同浓度AFB1-HRP抗原分别与步骤1)得到的DNA正四面体探针金电极孵育；

3)然后将步骤2)孵育后的DNA正四面体探针金电极与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号获得AFB1-HRP抗原浓度与聚苯胺的电化学信号的标准曲线；

4)将未知浓度待测样品、AFB1-HRP与步骤1)得到的DNA正四面体探针金电极孵育，然后与苯胺聚合缓冲液反应检测聚苯胺的电化学信号；

5)通过聚苯胺的电化学信号对应于标准曲线得出AFB1的浓度。