[发明专利]一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于FISH的快速标记基因组探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备dcas9蛋白：原核表达及纯化得到dcas9蛋白，将荧光染料标记dcas9蛋白；

（2）制备sgRNA库：从NCBI下载目标基因序列，针对目标基因区域保守序列，利用在线网站http : //crispr.mit.edu /分析可能的 sgRNA位点，其中PAM 序列为NGG，在每条sgRNA核心序列的5’端加上19bp的序列如SEQ ID NO.36所示，3’端加上86bp的序列如SEQ IDNO.37所示，得到一系列优化sgRNA序列，化学合成所述优化sgRNA序列，将合成的sgRNA序列连入pUC57-simple质粒，通过质粒PCR扩增、PCR产物体外转录、转录产物纯化，得到一系列sgRNA，即sgRNA库，PCR扩增引物如SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；

（3）构建sgRNA-dcas9酶探针库：将步骤（1）中所得的荧光染料标记的dcas9蛋白分别与步骤（2）中所得的sgRNA库混合组装，所述dcas9蛋白与所述sgRNA库按照摩尔比例为1:1-1:4进行混合组装，即得到sgRNA-dcas9酶探针库。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中的PCR扩增体系如下：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，共进行35个循环。

4.一种用于FISH的快速标记基因组探针，其特征在于：根据如权利要求1-3任一项所述的一种用于FISH的快速标记基因组探针的制备方法制备得到。

5.一种快速荧光原位杂交检测试剂盒，其特征在于：含有如权利要求4所述的用于FISH的快速标记基因组探针。

6.根据权利要求5所述试剂盒在制备用于快速荧光原位杂交检测产品中的应用。