[发明专利]一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：制备带有荧光染料标记的dcas9蛋白，再针对目标基因区域设计并合成sgRNA库，最后将带荧光染料标记的dcas9蛋白与sgRNA库混合得到sgRNA‑dcas9酶探针库。本发明制备所得sgRNA‑dcas9酶探针采用dCas9介导的FISH技术利用CRISPR系统进行DNA快速杂交，具有检测时间短（可在1小时内完成检测），准确性高，特异性好、假阳性低、操作条件温和（室温和37°C，可更好地维持细胞形态和DNA结构）、操作简便灵活、成本低等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用。

背景技术

由染色体畸变引起的疾病难以治愈，危害严重；目前，针对染色体异常检测的重要方法之一为荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)，该技术是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析；具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核，为疾病诊断提供可靠的依据，早发现早治疗，使患者减少痛苦。

然而目前荧光原位杂交方法耗时长，杂交条件苛刻；且探针有制备繁琐，批次差异比较大，特异性不高，信号背景偏高等缺点，基于此，有必要提供一种特异性高、杂交效率高且检测时间短的荧光原位杂探针及其制备方法。

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。CRISPR-Cas9 是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。Cas9 的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC 和HNH。这两个结构域分别负责切割 DNA链的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。当 RuvC 和HNH 同时处于失活状态 时 ( D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9将不具有核酸酶活性，成为 dCas9(deadCas9) 。dCas9 虽然没有剪切 DNA 的能力，但仍然可以在 gRNA 的引导下与特定的 DNA 序列结合。基于以上原理，应用cas9体系有开发出标记基因组DNA的潜力。

发明内容

本发明的目的是研发一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用，采用最新技术dcas9蛋白，在sgRNA的引导下标记靶基因，应用该方法标记基因具高效，快速，准确的特点，且样本可以包含非变性和变性两种。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明目的在于提供一种用于FISH的快速标记基因组探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备dcas9蛋白：原核表达及纯化得到dcas9蛋白，将荧光染料标记dcas9蛋白；

（2）制备sgRNA库：从NCBI下载目标基因序列，针对目标基因区域保守序列，利用在线网站http : //crispr.mit.edu /分析可能的 sgRNA位点，其中PAM 序列为NGG，在每条sgRNA核心序列的5’端加上19bp的序列如SEQ ID NO.36所示，3’端加上86bp的序列如SEQ IDNO.37所示，得到一系列优化sgRNA序列，化学合成所述优化sgRNA序列，将合成的sgRNA序列连入pUC57-simple质粒，通过质粒PCR扩增、PCR产物体外转录、转录产物纯化，得到一系列sgRNA，即sgRNA库，PCR扩增引物如SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；