[发明专利]一种茶树精油抗菌机制的研究方法

说明书

本发明公开了一种茶树精油抗菌机制的研究方法，本发明属于精油抗菌技术领域，包括以下步骤：扫描电镜观察菌体细胞膜的变化；茶树精油处理前后对菌体胞内大分子物质的影响；倒置荧光显微镜观察菌体核酸的变化；茶树精油处理前后细菌DNA含量的变化；茶树精油处理前后细菌蛋白质含量的变化。本发明提供的方法较为简单高效，能够直观准确的反映茶树精油的抗菌机制，为茶树精油进一步的应用提供理论基础。

技术领域

本发明属于精油抗菌研究领域，具体涉及一种茶树精油抗菌机制的研究方法。

背景技术

互叶白千层，又称茶油树，是茶树精油的主要原料，从互叶白千层新鲜枝叶中提取的茶树精油，属于天然油脂，富含松油精、柠檬油精、桉油酚、茴香素等，具有杀菌消炎、收敛毛孔、治疗伤风感冒、咳嗽、鼻炎、哮喘、改善痛经及生殖器感染等功效。适用于油性及粉刺皮肤，能够治疗化脓伤口及灼伤、晒伤及头屑。广泛用于皮肤保健品、化妆品、药品、食品香料等诸多领域。

目前，对茶树精油抗菌的研究大多停留在配方研究上，中国专利CN 108219940 A公布了一种杀菌微胶囊香料，该香料包含如下成分：百里香精油20-30份，茶树精油20-30份，广藿香精油5-10份，硅藻土2-7份，明胶15-20份，麦芽糊精25-30份。中国专利CN108142463 A公布了一种天然植物抗菌剂，它包括质量份数分别如下的原料：茶树精油6-7份、杏仁酸0.5-1份、芦荟提取物4-6份和紫草、红花、乌梅、升麻混合提取液20-25份、多元醇1-5份、 苯氧乙醇1-5份、乙基己基甘油1-5份、对羟基苯乙酮1-5份、抗氧化剂2-5份和去离子水40-60份。然而，国内专利对茶树精油其特定的抗微生物作用和其潜在抗菌机制仍未得到很好的表征。

本专利以变形杆菌和金黄色葡萄球菌为代表，提供一种研究茶树精油抗菌机制的方法，主要通过SEM观察细胞形态，并进一步测定细菌内蛋白质、DNA、大分子、核酸等的变化。

发明内容

针对现有研究中茶树精油抗菌机制的不明，本发明提供了一种高效、快捷表征茶树精油抗菌机制的方法，可以直观准确的说明茶树精油的抗菌机制，为茶树精油在抗菌方面的应用提供理论基础。

本发明的具体技术方案如下：

一种互叶白千层茶树精油抗菌机制的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）扫描电镜（SEM）观察菌体细胞膜的变化，具体将一定浓度的茶树精油置于菌液中，振荡培养，然后进行高速离心，加入一定量的戊二醛进行固定，菌体用乙醇梯度洗脱，最后用乙酸异戊酯置换，干燥喷金后扫描；

（2）茶树精油处理对菌体胞内大分子物质的影响，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加不同浓度的茶树精油振荡培养，高速离心收集上清液。紫外光分光光度计测定上清液的吸光度；

（3）倒置荧光显微镜（FIM）观察菌体核酸的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加一定浓度的茶树精油振荡培养，载玻片上滴加等体积的DAPI染色液和菌悬液样品进行暗反应，使用倒置荧光显微镜观察；

（4）茶树精油处理前后细菌DNA含量的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加一定浓度的茶树精油振荡培养，菌液高速离心，清洗并再次重悬，利用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取实验组和对照组菌体的DNA，紫外分光光度计测定吸光度；

（5）茶树精油处理前后细菌蛋白质含量的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加一定浓度的茶树精油振荡培养，菌液高速离心，清洗并再次重悬，利用蛋白质检测试剂盒分别测定实验组和对照组细菌的蛋白质含量。

更进一步的，上述步骤（1）中茶树精油在菌液中的浓度为0.5 mg/mL，试样置于37℃振荡培养4 h，8000 rpm离心10 min，加入2.5%戊二醛固定3-4 h，菌体用一系列梯度乙醇脱水10 min，置换时间为30 min；