[发明专利]一种肉牛肝细胞的原代培养方法

权利要求书

1.一种肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述肉牛肝细胞的原代培养方法：

第一步，肝脏组织，放入装有PBS的离心管中，进行清洗；

第二步，肝脏组织从离心管中取出放入装有70％酒精的培养皿中浸泡消毒；

第三步，消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗2-3次，分成小块；

第四步，洗好的肝脏组织在培养皿中剪碎，加入3-5倍体积的Ⅱ型胶原酶在37℃培养箱中消化20-30分钟，每隔5min晃动培养皿，让组织和胶原酶充分接触；

第五步，在显微镜下观察到大量肝细胞游离出来用1：1的比例加入含有10％血清的培养基终止消化；

第六步，用100、200目细胞筛网过滤消化液，再用400目细胞筛网过滤一次；

第七步，过滤后的滤液转移到离心管中，离心；

第八步，倒掉上清液，加入DMEM/F-12生长培养基用吸管吹打细胞，分散成单个细胞；

第九步，把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养。

2.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第一步放入装有含5倍双抗的4℃PBS的50mL离心管中。

3.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第四步的Ⅱ型胶原酶浓度为1mg/mL，即0.1％。

4.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第七步过滤后的滤液转移到15mL离心管中，1200g离心5分钟。

5.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第八步的DMEM/F-12生长培养基内含10％胎牛血清，5mg/L牛胰岛素，5mg/L转铁蛋白，0.5mg/L地塞米松，10ng/mL表皮生长因子，100IU青霉素及0.1mg/mL链霉素。

6.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第九步的接种密度1.5×10⁵个/mL，把培养瓶放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

7.如权利要求1所述的肉牛肝细胞的原代培养方法，其特征在于，所述第九步之后需要肉牛肝细胞密度达到80％-90％即可传代培养及鉴定。