[发明专利]一种肉牛肝细胞的原代培养方法

说明书

本发明属于细胞原代培养技术领域，公开了一种肉牛肝细胞的原代培养方法；肝脏组织放入含有5倍双抗的冷PBS的离心管中；放入培养皿中浸泡消毒；消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗；洗好的肝脏组织在培养皿中剪碎，培养箱中消化；加入含有10％血清的培养基终止消化；分别用100目、200目细胞筛网过滤消化液；再用400目细胞筛网过滤一次；过滤后的滤液转移到离心管中，离心；倒掉上清液，加入DMEM/F‑12生长培养基用吸管轻轻吹打细胞；把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养；肉牛肝细胞传代培养及鉴定。本发明分离培养肉牛肝细胞操作简单、成本低、对肝脏组织的样本采集要求不高。

技术领域

本发明属于细胞原代培养技术领域，尤其涉及一种肉牛肝细胞的原代培养方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：目前，牛肝细胞的培养一般采用犊牛的肝脏组织，常用两步胶原酶灌流法进行：牛屠宰后取肝脏的尾状突，用灌流液清洗后在肝脏组织中选取粗细合适的血管分别用灌流液A和灌流液B进行灌流，然后再用灌流液C进行灌流消化肝组织。还有用一步灌流结合组织消化法进行牛肝细胞的原代培养：用灌流液A和灌流液B通过血管对肝脏组织进行灌流，然后把肝脏组织剪成小块用加入Ⅳ胶原酶进行消化。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)在灌流过程中，需要结扎血管，灌流液温度保持37℃，对灌流的速度要求高，操作步骤繁琐。

(2)灌流过程中需要大量的胶原酶，成本高。

(3)对采集的肝脏组织要求高，需保留血管且血管粗细适宜以便于后续的灌流。

(4)需要采集的肝脏组织多，不适合通过活体采集牛肝脏组织来分离牛肝细胞。

(5)试验动物通常是犊牛，不适合成年牛肝细胞的分离，也无法在体外模拟成年牛肝细胞代谢相关的研究。

解决上述技术问题的难度：采用胶原酶组织消化法分离培养肝细胞并保持其活性和增殖能力。

解决上述技术问题的意义：采用胶原酶组织块消化法培养肉牛肝细胞操作简单、经济，不仅可以用于犊牛肝细胞的培养，而且也适合于成年牛肝细胞的分离培养，尤其可用于肉牛活体采集的肝脏组织来分离培养肝细胞，这对体外模拟研究肉牛肝脏功能及肝细胞代谢调控机制具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肉牛肝细胞的原代培养方法。

本发明是这样实现的，一种肉牛肝细胞的原代培养方法，所述肉牛肝细胞的原代培养方法

第一步，肝脏组织，放入装有PBS的离心管中，进行清洗；

第二步，肝脏组织从离心管中取出放入装有70％酒精的培养皿中浸泡消毒；

第三步，消毒后的肝脏组织在培养皿中用含双抗的PBS清洗2-3次，一边清洗一边把肝脏组织周围的筋膜及血管剔除，把剩下的肝组织剪成小块，以去除血液；

第四步，洗好的肝脏组织在培养皿中用眼科剪剪碎成1mm³，加入3-5倍体积的Ⅱ型胶原酶在37℃培养箱中消化20-30分钟，每隔5min晃动培养皿，让组织和胶原酶充分接触；

第五步，按1：1的比例加入含有10％血清的培养基终止消化；

第六步，用100目、200目细胞筛网过滤消化液，然后再用400目细胞筛网过滤一次；

第七步，过滤后的滤液转移到离心管中，离心；

第八步，倒掉上清液，加入DMEM/F-12生长培养基用吸管轻轻吹打细胞，使其分散成单个细胞；

第九步，把吹打均匀的细胞悬液接种到培养瓶中，把培养瓶放入培养箱中培养。