[发明专利]一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，其特征在于，

所述结合垫上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-TATGTCCATGGCCGCATATT；

所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针：

所述捕获探针的核苷酸序列为：TTTGGACTATGTGGAAGTT；

所述质控探针的核苷酸序列为：AATATGCGGCCATGGACATA。

2.根据权利要求1所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备样品垫；

S2.制备结合垫，在结合垫上包被金标探针；

S3.硝酸纤维素膜的处理：采用喷金仪将捕获探针和质控探针以0.5-0.8μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，所述检测线和质控线之间的距离为5～6mm；

S4.胶体金试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，各相邻的部件相互重叠2～3mm，然后将其整体切成4mm宽，避光保存。

3.根据权利要求2所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述S1具体为：将玻璃纤维置于含有0.5％TritonX-100、2％蔗糖、1％牛血清白蛋白(BSA)、50mM硼酸，pH 8.0的溶液中浸泡后，室温干燥12h制成。

4.根据权利要求2所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：

a.胶体金的合成：取200ml浓度为0.01％的HAuCl₄溶液搅拌并加热至沸腾，加入8ml浓度为1％的柠檬酸三钠，待溶液变为葡萄酒红色，继续沸腾5min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到胶体金溶液；

b.胶体金-核酸适配体复合物的制备：将步骤①所得胶体金溶液进行10倍浓缩，取400μl浓缩液加入金标探针，于4℃摇晃12h；然后加入浓度为10％的BSA，反应4h，得到胶体金-核酸适配体复合物；

在所述复合物中添加1％的十二烷基硫酸钠至其终浓度为0.01％，再加入浓度为1.5mol/L的NaCl溶液使盐离子终浓度为150mM，所得复合溶液置于4℃反应12h；

c.将步骤b所得的复合溶液以12000rpm的转速离心10～20min，并用缓冲液清洗三次，丢弃上清，将所得颗粒重悬在150μl的缓冲液中，得到胶体金-核酸适配体结合溶液，于4℃保存；

d.取步骤c所得的胶体金-核酸适配体结合溶液2～3μl滴加在所述结合垫上，室温风干5min，即得包被有金标探针的结合垫。

5.根据权利要求4所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述步骤c中的缓冲液为含有20mM Na₃PO₄、5％BSA、0.25％吐温以及10％蔗糖的溶液。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

①病毒孵育：取100μl磷酸盐缓冲液，加入捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)，使所述捕获适配体和扩增适配体的浓度分别为200nM，再加入石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染的细胞孵育10～15min，得到含SGIV的混合物；

②链置换反应：将2μl经链霉亲和素修饰的磁珠加入所述混合物中，振荡10～15min，得到Aptamer1-SGIV-Aptamer2-磁珠复合物，用磁器分离架将其收集，并用PBST洗涤三次，将复合物转移到离心管中进行链置换反应，得到链置换反应产物；

③取样检测：取步骤②的链置换反应产物滴加在胶体金试纸条的样品垫上，反应5min，观察胶体金试纸条的显色结果；

④结果判读：

阳性反应：胶体金试纸条的检测线、质控线均显色；

阴性反应：胶体金试纸条的检测线不显色，质控线显色。