[发明专利]人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用

权利要求书

1.人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌，其特征是：包括hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌，是将所述hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-hsCD80融合基因主要由hsCD80基因和CTB基因连接而成，且在所述hsCD80基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述hsCD80基因的胞外区结构域的N端引入分泌性信号肽SPK1；

所述人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌的制备方法，包括以下步骤：

一、hsCD80融合基因SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80的合成：

（1.1）根据SPK1信号肽氨基酸序列，对密码子进行优化，获得SPK1基因cDNA序列，其序列表如SEQ ID NO：1所示；

（1.2）根据hsCD80基因序列及功能区域结构，并对密码子进行优化，获得只含hsCD80胞外区结构域的hsCD80基因cDNA序列，其序列表如SEQ ID NO：2所示；

（1.3）根据CTB基因序列，并对密码子进行优化，获得CTB基因cDNA序列，其序列表如SEQID NO：3所示；

（1.4）将所述SPK1和所述hsCD80基因的cDNA序列连接起来形成融合基因，并在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列，合成SPK1-hsCD80基因；

（1.5）将所述SPK1、CTB、hsCD80基因的cDNA序列连接形成融合基因，并在CTB与hsCD80基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在融合基因5’端和3’端分别加入NcoI和XbaI限制性核酸内切酶酶切序列，合成SPK1-CTB-hsCD80融合基因；

二、hsCD80和CTB-hsCD80融合基因转化体的构建

（2.1）将SPK1-hsCD80和SPK1-CTB-hsCD80融合基因乳酸菌表达载体pLN中，得到连接物；

（2.2）采用电击转化法，将连接物转化到LacF基因缺失的乳酸乳球菌中，电击后，采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基EM筛选获得hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌。

2.根据权利要求1所述的人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌，其特征是：所述转化乳酸菌不含耐药基因，其能在肠腔内或体外诱导表达并分泌重组蛋白hsCD80和/或CTB-hsCD80。

3.权利要求1所述的人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌在制备具有疾病免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用；所述疾病为肿瘤，所述肿瘤为结肠直肠癌或黑色素瘤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述口服活菌药物为活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊。