[发明专利]一种DNA文库构建方法

说明书

本发明提供了一种DNA文库构建方法，该方法包括如下步骤：(1)将DNA片段5’末端去磷酸化；(2)提供接头混合物，所述接头混合物包括平末端接头和带有不同长度粘末端的接头；(3)使所述接头混合物中接头的5’末端与去磷酸化的DNA片段3’末端连接；(4)通过切口平移法使接头混合中接头的3’末端与所述DNA片段5’末端相连。

技术领域

本发明提供涉及DNA文库的构建方法，以及使用该文库测序一个或多个靶核酸的方法及其组合物、试剂盒。

背景技术

核酸序列编码生物功能和繁殖所必需的信息。因此，对核算序列进行测序是对生物体进行研究，以及在疾病诊断和药品开发等应用中非常重要的基础技术。在医学领域，测序方法通常被用于诊断和治疗各种疾病，例如包括癌症、传染病、自身免疫疾病、遗传性疾病等。为了使测序技术能更加普及地用于各种用途，一方面需要更高通量和/或更低成本的核酸测序技术，另一方面还需要能够对更加微量的核酸进行测序。对微量核酸进行测序在某些情况下尤为重要，例如通过对母体外周血游离核酸进行测序来检测胎儿相关核酸序列，以及通过对患者外周血游离核酸测序来诊断癌症等。

目前的二代测序(next generation sequencing，NGS)基础是测序文库的构建。文库构建流程通常包括：(1)将未片段化的基因组DNA进行超声波打断，或者酶片段化处理(如使用血浆游离DNA或其它已片段化的DNA可省略此步)；(2)将DNA片段进行末端缺口补齐修复；(3)在经过末端修复的DNA片段的5’末端磷酸化，3’末端添加单碱基A(腺嘌呤)以便获得具有单个碱基粘性末端；(4)将具有粘性末端A的DNA片段与根据不同测序平台设计的接头相连(接头可带样本标签)，以获得连接产物；(5)如果是对靶向富集区域测序(如全外显子组测序或NGS panel测序)，通过接头上的各测序平台的通用引物对连接产物进行PCR，以获取足量的扩增后的DNA文库(在此步亦可引入样本标签)；(6)将扩增后的DNA文库用探针捕获法或靶向引物法进行目标区富集制备测序文库。

NGS建库方法的设计会直接影响起始DNA通过与接头连接进入文库的转化率，进而影响到最终测序文库的产量与可分析的起始DNA分子多样性(DNA complexity)。传统方法在建库中存在的普遍问题包括：DNA平末端或经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A获得的单个碱基粘性末端连接效率低，5’末端不完全的磷酸化阻止连接，3’末端非特异的添加碱基A(误加G、C、T)阻碍接头与DNA的有效AT连接，以及接头和目标DNA的自连接阻碍阻碍接头与DNA连接。5’末端3’末端由于传统建库方法中存在的连接效率较低的问题，起始DNA用量要求较高，如果起始DNA不足则需要通过PCR扩增的方法提高文库产量以便于流程下游样本处理。但是PCR扩增会引入重复序列和错误降低测序质量。以游离DNA(cell freeDNA，cfDNA)为例，1ng的cfDNA含有约330个基因组拷贝，如果使用10ng的起始DNA，最后的最大理论测序深度应该在3300，但是运用传统NGS建库方法，大部分起始DNA无法完成建库的转化率。最后在临床应用中测序有效深度一般只会是理论测序深度的一小部分。

为对微量DNA进行测序，亟需开发一种DNA文库构建方法，以提高DNA文库转化效率和质量以及测序效率。

发明内容

本发明开发了一种新型DNA测序或基因型分型文库构建方法，该方法提高了接头的多样性，从而能够与具有不同末端的天然DNA以及通过机械或酶方法片段化的DNA进行有效连接。

在一些实施方案中，本发明提供了一种DNA文库构建方法，其中所述方法包括如下步骤：(1)将DNA片段5’末端去磷酸化；(2)提供接头混合物，所述接头混合物包括平末端接头和带有不同长度粘末端的接头；(3)使所述接头混合物中接头的5’末端与去磷酸化的DNA片段3’末端连接；(4)通过切口平移法(nick translation)使接头混合中接头的3’末端与所述DNA片段5’末端相连。