[发明专利]基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法

权利要求书

1.基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

提取褐菖鲉基因组DNA；

将所述基因组DNA酶切，酶切液中加入Adapter接头进行接头连接；

将所述接头连接获得的不同样品DNA片段混合，进行PCR扩增，然后将产物进行测序；

将测序得到的原始数据分选聚类，按样品个体进行数据质控并删除Adapter接头序列，将序列比对到参考基因组上，提取SNP位点，筛选用于群体遗传结构分析的SNP位点；

所述提取褐菖鲉基因组DNA的具体步骤为：

用生理盐水或者磷酸盐缓冲液清洗褐菖鲉肌肉组织样本，得待裂解样本；

用含NaOH、Na₂EDTA、二硫苏糖醇和N-月桂酰肌氨酸钠的裂解液裂解所述待裂解样本，所述裂解液中NaOH的终浓度为0.3-0.4M，Na₂EDTA的终浓度为5-8M，二硫苏糖醇的终浓度为0.01-0.05mM，N-月桂酰肌氨酸钠的终浓度为0.4-0.6M，得DNA粗产物；以及

先用含有磷酸盐缓冲液和乙酸钾的洗涤液I处理所述DNA粗产物，再用含有乙酸钠和巯基乙酸钠的洗涤液II继续处理，得纯化后的DNA。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述洗涤液I中磷酸盐缓冲液的终浓度为0.05-0.15M，乙酸钾的终浓度为0.01-0.04M。

3.根据权利要求1所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述洗涤液II中乙酸钠的终浓度1.0-2.0M，巯基乙酸钠的终浓度0.3-0.5mM。

4.根据权利要求1所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述酶切用酶为限制性内切酶EcoRI/PstI。

5. 根据权利要求1所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述Adapter接头用序列为：EcoRI Adaptor-1：5’-GTACTACCGTACTCGGC-3’；EcoRI Adaptor-2：5’-GTATATGACCGTACG-3’；PstI Adaptor-1：5’-GCAAGTGGCTTCAAGTG，PstI Adaptor-2：5’-CAGTGATACATCGTC-3’。

6. 根据权利要求5所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述Adapter接头按照如下方法配置：EcoRI-Adaptor含有：EcoRI-Adaptor-1 10μL，EcoRI-Adaptor-2 10μL，H₂O 80μL；PstI-Adaptor含有：PstI-Adaptor-1 30μL，PstI-Adaptor-230μL，H₂O 40μL。

7.根据权利要求1所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述PCR扩增用引物序列为：primer-F：5’-GAGTGATTGCTACACAG-3’；primer-R：5’-GTATGACGCCATACTCA-3’。

8. 根据权利要求1所述的基于高通量测序的褐菖鲉SNP检测方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：95℃变性3min；95℃ 10s，55℃ 40s，72℃ 40s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。