[发明专利]一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法

说明书

本发明属于分子杂交检测技术领域，具体涉及一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法。所述杂交缓冲液中各组分的配比为：15％去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mMNaH₂PO₄。本发明所述杂交缓冲液特别适用于细菌类FISH检测，使用本发明所述杂交液进行FISH杂交具有结果特异性高、结果背景低、使用方便、成本低等优点。

技术领域

本发明属于分子杂交检测技术领域，具体涉及一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法。

背景技术

FISH实验是通过碱基互补配对的力学原理，将特异的带有标签的探针序列与目的基因片段互补配对，再通过荧光或者化学反应显示结合点的位置以及数量。

核苷酸探针是原位杂交中检测组织细胞中RNA的一种通用型工具，通常有cRNA，cDNA以及寡核苷酸探针。其中寡核苷酸探针的合成较其他两种更加简单便捷，成本低。特异性的寡核苷酸探针，需要在特定的杂交环境下，控制探针只和靶序列结合。这里就需要杂交液这一工具，并配合杂交温度，利用的是碱基互补配对中退火杂交温度的原理。

绝大部分细菌rRNA序列内都有其特异的一段核酸序列，这段序列即可作为一段特异探针，且由于rRNA在组织内量多且聚集，末端标记荧光素的方式合成的寡核苷酸探针，可达到检测目的。目前文献资料中的应用于细菌FISH的杂交液，普遍含有硫酸葡聚糖，二硫苏糖醇，鲑鱼精DNA等成分，产品成分较多，且效果欠佳。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液，各组分配方包括：去离子甲酰胺、SSC、EDTA、Denhardt、NaH₂PO₄和DEPC水。

上述方案中，所述杂交缓冲液中各组分的配比为：15％(体积比)去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mM NaH₂PO₄。

适用于细菌FISH检测的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：

(1)组织切片预处理，包括：组织切片固定、脱蜡、水洗、通透、消化；

(2)预杂交：向经步骤(1)预处理后的组织切片滴加所述杂交缓冲液，37℃孵育1小时，倾倒去除杂交缓冲液；

(3)杂交：在组织切片上滴加含标记的寡核苷酸探针的杂交液缓冲液，盖上盖玻片，37℃杂交过夜；

(4)洗涤：用SSC洗脱液洗去杂交液；

(5)复染细胞核及封片，在荧光显微镜下观察荧光信号，采集图像。

上述方案中，所述组织切片脱蜡至水洗的具体过程为：依次将组织切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85％酒精(体积浓度)5min，75％酒精(体积浓度)5min，DEPC水洗。

上述方案中，所述组织切片通透的具体过程为：将组织切片置于1×修复液中90℃、5～10分钟，随后自然冷却；所述修复液为DEPC和水按1:19稀释所得。

上述方案中，所述组织切片消化的的具体过程为：滴加蛋白酶K工作液消化15～20min。

上述方案中，步骤(4)所述洗涤的具体过程为：2×SSC，37℃洗10min；1×SSC，37℃洗2×5min；0.5×SSC室温洗10min。