[发明专利]一种叶绿体DNA的富集方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种叶绿体DNA的富集方法。本发明的方法基于植物细胞中的叶绿体DNA与细胞核DNA甲基化位点存在的差异，利用带有蛋白A修饰的磁珠，通过MBD2‑Fc蛋白媒介，将植物基因组DNA中的细胞核DNA和叶绿体DNA进行分离，并进一步实现对叶绿体DNA的富集。利用本发明的方法，在测序前进行叶绿体DNA的富集，然后对富集后的叶绿体DNA进行测序，可有效提高测序数据中叶绿体DNA序列的比例，显著提高测序的准确度、降低测序成本。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种植物叶绿体DNA的富集方法。

背景技术

叶绿体DNA测序已经被广泛应用于分类学和系统进化的研究，完整的叶绿体DNA测序可以为复杂的进化关系提供有用的依据，提高物种的分类水平。与细胞核基因组相比，叶绿体基因组是母系单方面遗传，在进化变异速度上较慢。通过二代测序发现的叶绿体基因组中的SNP和插入缺失突变可能成为未来不同分类水平上的分子标记。

植物的大多数遗传物质都来源于细胞核，只有很少一部分来源于其他细胞器，所以对植物基因组进测序所得到的数据信息大多来源于细胞核DNA，而检测到的叶绿体DNA非常少，特别是对于基因组较大的物种，例如水稻、小麦等，叶绿体DNA所占的比例就更少。将植物基因组DNA进行二代测序，从中过滤掉其他信息，筛选出叶绿体DNA信息的方法对与基因组较大的物种成本过高。这就需要我们寻找有效的方法去除植物细胞核DNA的干扰，获得更多的叶绿体DNA。在现有的DNA提取方法的基础上优化提取过程中盐离子浓度和pH值所得到的叶绿体DNA存在细胞核DNA残留，质量降低等问题，很难满足后续测序要求。

此外，如采用蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体DNA，耗时长，操作繁琐，产率低，对设备要求高，密度梯度液不易保持。而采用DNaseI法提取叶绿体DNA，则药品较贵，提取时间长，难以使叶绿体膜保持完整，导致叶绿体DNA的得率很低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种叶绿体DNA的富集方法，以实现更高效率地针对植物的叶绿体DNA进行测序或其他分子生物学研究。

为解决上述技术问题，本发明所提供的叶绿体DNA的富集方法，包括：(1)提取植物基因组DNA；(2)使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合，得到处理后的磁珠；(3)将所述植物基因组DNA加入所述处理后的磁珠中，混匀，对混合物进行室温下孵育；(4)对孵育后的混合物离心，于磁力架上静置，细胞核DNA通过与磁珠上的MBD2-Fc蛋白结合而附着到磁珠上，叶绿体DNA保留在上清液中，取上清液；(5)使用磁珠对所述上清液中的叶绿体DNA进行回收。

与现有技术相比，本发明至少具有如下的有益效果：

本发明的申请人提出，植物细胞中细胞核DNA与叶绿体DNA的甲基化位点存在差异：植物细胞核DNA上存在很多甲基化位点，叶绿体DNA上的甲基化位点则非常少。而MBD2-Fc蛋白由两部分组成：MBD2蛋白可以特异地跟甲基化的CpG结合，Fc是人类IgG上的Fc片段，它可与磁珠上的蛋白A结合。申请人利用带有蛋白A修饰的磁珠，通过MBD2-Fc蛋白媒介，将植物基因组DNA中的细胞核DNA和叶绿体DNA分离，并进一步实现对叶绿体DNA的富集。

利用本发明的方法，即可通过简便的操作、快速地在测序前对植物细胞中的细胞核DNA与叶绿体DNA进行分离、并对叶绿体DNA进行富集，然后对富集后的叶绿体DNA进行测序，可有效提高测序数据中叶绿体DNA序列的比例，显著提高测序的准确度、降低测序成本。

优选地，步骤(1)中，在提取植物基因组DNA时，保证所述植物基因组DNA的完整性，并且完全去除植物蛋白，以免影响后续蛋白相互结合的实验。

优选地，步骤(1)中，提取植物基因组DNA可使用试剂盒或其他植物基因组DNA的提取方法，例如可以选用的提取方法为：对待提取样本使用蛋白酶K处理，然后用酚氯仿或酒精提取。