[发明专利]一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法

权利要求书

1.一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：

(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；

(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3⁺T细胞；

(3)利用免疫磁珠去除流式分选出CD3⁺T细胞中的死细胞；

(4)将去除死细胞后的CD3⁺T细胞进行单细胞转录组建库、VDJ建库及测序；

(5)将测序后的数据进行分析，然后筛选肿瘤特异CD8⁺T细胞及TCR。

2.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作步骤为：

(a)首先将离体手术切除肿瘤组织置于无菌平皿内，利用无菌PBS或Hank’s溶液将肿瘤组织进行反复冲洗，并减去结缔组织和脂肪组织，然后将肿瘤组织剪碎；

(b)在剪碎的肿瘤组织中加入组织消化液混匀于37℃摇床消化1-2h；

(c)将消化后的肿瘤组织中加入HBSS溶液终止消化，使用移液管将组织液转移至70μm筛网中过滤至离心管中，1800r/min，离心8min；

(d)将离心后的组织液弃去上清液，用Hank’s溶液洗涤，然后离心弃掉上清液，加入培养液重悬细胞，计数细胞。

3.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作步骤为：

①将计数为10-50×10⁶个组织浸润单个核细胞，离心后弃掉上清，用纯化缓冲液清洗，然后1800rpm/min 4℃离心8min；

②将离心后的上清液弃掉，用200μL纯化缓冲液将沉淀细胞重悬，加入荧光抗体，4℃避光孵育30min后，用纯化缓冲液清洗，然后1800rpm/min 4℃离心8min，弃掉上清，用500μL纯化缓冲液将沉淀细胞重悬；

③将细胞重悬液经40μm的筛网过滤去除粘连的细胞团块，然后将过滤的细胞重悬液经7-AAD染料进行表面分子染色，利用BD Aria II收集射门于单细胞中的7-AAD-CD45-V450⁺CD3-PE-CF594⁺细胞群。

4.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：将流式分选的CD3⁺T细胞进行离心，然后用无菌PBS洗涤，然后取45-55μL无菌PBS重悬细胞，取等量的细胞悬液和胎盘蓝混合，利用Life Count细胞计数仪计数细胞及细胞活率，细胞活率<80％利用美天旎磁珠去死细胞磁珠做去死细胞处理。

5.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作为：利用磁珠标签技术标记去除死细胞后获得的单细胞，使同一个细胞的每条RNA都标记上同样的标签，逆转录和酶切后，分别进行转录组和VDJ扩增，最后对扩增的转录组和VDJ进行测序。