[发明专利]一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法

说明书

本公开提供了一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，具体步骤为：(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3⁺T细胞；(3)利用免疫磁珠去除流式分选出CD3⁺T细胞中的死细胞；(4)将去除死细胞后的CD3⁺T细胞进行单细胞转录组建库、VDJ建库及测序；(5)将测序后的数据进行分析，然后筛选肿瘤特异CD8⁺T细胞及TCR。所述方法针对每个未知抗原的样本，能够在其肿瘤抗原未知的情况下，筛选出其肿瘤特异性T细胞及TCR。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法。

背景技术

目前传统手术、放疗和化疗无法彻底清除肿瘤细胞，无法解决肿瘤转移复发的问题。免疫系统对突变细胞和肿瘤细胞执行监视、清除、调节和免疫记忆功能，通过免疫疗法激活患者自体免疫系统，依靠自身的免疫机能杀灭肿瘤细胞，因而能防止肿瘤的复发和转移。随着近年肿瘤免疫治疗方面的研究突飞猛进，人们攻克癌症的梦想已越来越近，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells，CAR-T)可以治愈90％的白血病，PD-1/CTLA-4抗体通过调节T细胞功能使免疫正常化，极大提高了多种实体瘤的缓解率和5年生存率，并获2018年诺贝尔生理医学奖。因而，越来越多的学者坚信，免疫治疗将是人类战胜肿瘤的终极武器。

免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除主要依赖T细胞介导的细胞免疫，通过增强抗肿瘤细胞免疫反应，修复机体免疫监视、防御和调控功能的过继T细胞(adoptive celltransfer therapy，ACT)疗法克服了传统治疗技术的局限性，经过大半个世纪的发展，已从基础理论研究发展到临床应用阶段，以突出的安全性和有效性，为中晚期患者实现长期“带瘤生存”提供了一条新路。

ACT疗法包括肿瘤浸润T细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL)疗法、CAR-T细胞疗法、和T细胞受体(T cell receptor，TCR)疗法。TIL过继回输治疗在以黑色素瘤为代表的多种恶性肿瘤中均显示了良好的临床疗效，但因体外扩增获得足够数量的TIL非常困难，其临床应用受到了极大地限制。CAR-T细胞疗法和TCR疗法作为当前ACT领域两大最新技术，因经过基因工程修饰患者外周血中的T细胞，使其表达CAR或新的能识别癌细胞的TCR，从而人为赋予普通T细胞靶向识别肿瘤的能力，且基于遗传改造技术可获得特异性功能加强版T细胞，而受到广泛的关注并成为研究热点，在已进行的临床试验中，被证实具有良好的疗效，研究成果被Science、Nature等顶级杂志争相报道。与TCR不同的是，CAR是将识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)与T细胞活化序列嵌合，故其应用仅限于已知靶抗原的肿瘤，如CD19⁺的B细胞淋巴瘤，且易引发“细胞因子风暴”和“脱靶效应”，产生较强的副反应，且已有的临床研究发现，CAR-T对实体瘤的治疗效果远不如TCR-T。

TCR是T细胞表面的一种受体分子，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答。由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR转入普通T细胞中，能够赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再转输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR-T，近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。

TCR分子主要由α和β两条链组成，其编码基因V，(D)J，C在T细胞发育过程中经过胚系重排，在胸腺中经过阳性选择和阴性选择过程，成为具有MHC识别限制性。机体成熟T细胞所产生的TCRαβ组成了一个能与成千万种抗原结合的抗原识别受体库(Repertoire)，从理论上估计，TCRαβ受体库的容量在1015以上。