[发明专利]一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途

说明书

本发明公开了一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法及其用途，以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物后PCR扩增，所得vp19和vp28融合基因和pRL489质粒连接构建vp19和vp28穿梭载体，并将其转入大肠杆菌，与含有pR4‑pRL‑542质粒的大肠杆菌和纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期混合，三亲接合转移后筛选蓝藻转化子，继续培养得到。以其为有效活性成分的口服制剂实现增强南美白对虾抵抗WSSV的用途，效果显著且易于控制成本，为对虾养殖中抵抗WSSV的有效药物提供基础。

技术领域

本发明涉及一种将vp19和vp28基因表达构建穿梭载体的方法，涉及到质粒载体重组构建、引物合成、酶切、普通PCR、三亲接合转移法、RT-PCR的方法,还涉及vp19和vp28穿梭载体的转基因蓝藻和其在增强南美白对虾抵抗WSSV的用途，属于蓝藻生物工程和藻类分子生物学方向。

背景技术

目前，Witteveldt等首次将vp19和vp28的N末端与麦芽糖结合蛋白(maltosebinding protein，MBP)融合并在细菌中表达后进行纯化，通过肌肉注射来免疫斑节对虾。在免疫斑节对虾后的第2天和第25天进行攻毒实验，发现与对照组斑节对虾相比，接种vp19疫苗的斑节对虾在第2天和第25天相对存活率分别达到33％、57％。此外，接种vp28疫苗的组在接种后2天的相对存活率为44％，但在第25天没有保护效果。结果表明，亚基疫苗vp19和vp28可以提高斑节对虾的存活率且vp28的免疫效果好于vp19，但vp28的免疫时间相对于vp19较短。Parin等把vp19基因通过pMAL-C2表达载体转入BL21大肠杆菌后，用得到的蛋白纯化制备单克隆抗体，用得到的单抗检测WSSV，结果显示联合应用vp19和vp28特异性单抗比单用单抗的敏感性高出两倍。Ha等利用囊膜蛋白vp19的抗体，Li等利用囊膜蛋白vp28的抗体，分别证实了这两种抗体对对虾有明显的保护作用，存活率分别为93.3％、83.3％，Li等通过试验发现，在15-22℃的环境温度下，使用vp19+28融合蛋白的血清免疫过的小龙虾受WSSV感染后存活率能达到100％，但在26℃的温度下存活率只有65％，结果表明vp19+28融合蛋白的血清对可以提高小龙虾的存活率，但存活率受温度响较大，稳定性不是很好。

白斑病是由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)引起的，每年对全球对虾养殖业造成巨大的经济损失，是一种杆状DNA病毒，虾一旦感染WSSV，就会发展为白斑综合症，然后在2-7天内迅速死亡，死亡率高达100％，至今尚无规模应用的有效药物防治，对虾生产上一般采用养殖抗病力强的品种或者切断WSSV传播途径等方法来预防WSSV的传播。前人研究主要将vp19或vp28蛋白融合进大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等载体，并进行纯化后的实验，但仅局限于小规模室内实验，且细菌等无法直接投喂对虾充当饵料，并无大规模的商业应用场景。

发明内容

本发明解决的技术问题是克服现有技术中vp19和/或vp28蛋白融合进大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等载体用于预防WSSV的局限性，采用聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC7942)表达WWSSV上含量较多的囊膜蛋白vp19和vp28，并从转录和翻译水平检测融合蛋白的表达，为研发防治WWSSV疫苗奠定基础，提供一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，还包括上述vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻在增强南美白对虾抵抗WSSV的用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

第一方面，一种vp19和vp28穿梭载体转基因蓝藻的构建方法，构建vp19和vp28的穿梭载体后转录入蓝藻得到，其构建方法包括以下步骤：

(ⅰ)以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物对如SEQ ID.NO.1至SEQ ID.NO.4所示，用PCR法扩增获得vp19和vp28融合基因，其碱基序列如SEQ ID.NO.5所示；