[发明专利]一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用

权利要求书

1.一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括以下步骤：

(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上，所述靶位点1序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述靶位点2序列为SEQ ID NO.2所示的序列；

(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1 E1 F和dmrt1 E1 R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1 E3 F和dmrt1 E3 R扩增靶位点2及附近序列；

(3)以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，用dmrt1 E1 gRNAF和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1 E3 gRNAF和gRNAR进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；

(4)以pXT7-hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9 mRNA；

(5)将Cas9 mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；

(6)检测突变类型，计算基因编辑率。

2.根据权利要求1所述系统，其特征在于，步骤(2)中所述引物dmrt1 E1 F的序列为SEQID NO.3所示的序列；所述引物dmrt1 E1 R的序列为SEQ ID NO.4所示的序列；所述引物dmrt1 E3 F的序列为SEQ ID NO.5所示的序列；所述引物dmrt1 E3 R的序列为SEQ ID NO.6所示的序列。

3.根据权利要求1所述系统，其特征在于，步骤(3)中所述引物dmrt1 E1 gRNA F的序列为SEQ ID NO.7所示的序列；所述引物dmrt1 E3 gRNA F的序列为SEQ ID NO.8所示的序列；所述引物gRNAR的序列为SEQ ID NO.9所示的序列。

4.根据权利要求1所述系统，其特征在于，步骤(3)所述gRNA纯化方法为LiCl沉淀法，具体步骤为：向gRNA体外转录体系中加1ul 0.5M的EDTA终止反应后，加2.5ul 4M的LiCl和75ul预冷的无水乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀物；再加1mL预冷的75％乙醇清洗沉淀物，离心，收集沉淀物，去除乙醇；加50ul Nuclease-free水溶解gRNA沉淀后，Nanodrop检测浓度，并于-80℃保存。

5.根据权利要求4所述系统，其特征在于，所述沉淀具体为-20℃沉淀16h或-80℃沉淀2h。

6.根据权利要求1所述系统，其特征在于，所述步骤(5)具体为：将浓度为600ng/ul的Cas9 mRNA和浓度均为120ng/ul的两种gRNA按2:1:1的体积混合均匀，显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中，注射剂量为1nL。

7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述步骤(6)具体为：收集出膜的小鱼苗20尾，提取基因组DNA后；PCR扩增靶位点及附近序列，PCR产物一部分直接送去Sanger测序，根据测序峰图初步检测基因编辑的效果；将剩下的PCR产物回收纯化，连接PMD-18T载体，挑选阳性单克隆送去Sanger测序，根据测序结果确定具体的突变类型，预测氨基酸序列的变化；用dmrt1 E1 F和dmrt1 E3 R这对引物PCR扩增突变体和野生型基因组，琼脂糖凝胶电泳检测是否发生长片段缺失突变；计算基因编辑效率。

8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述的基因编辑效率计算公式为：基因编辑效率＝1-(1-a)*(1-b)，其中a为靶位点1的突变率，b为靶位点2的突变率。

9.一种如权利要求1所述在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统应用于研究dmrt1基因对黄颡鱼性别决定和分化的作用以及黄颡鱼优质亲本的分子模块育种。