[发明专利]一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用

说明书

本发明公开了一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包括以下步骤：(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1 E1 F和dmrt1 E1 R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1 E3 F和dmrt1 E3 R扩增靶位点2及附近序列；(3)以pUC19‑gRNA‑scaffold质粒为模板，用dmrt1 E1 gRNA F和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1 E3 gRNA F和gRNA R进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；(4)以pXT7‑hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9 mRNA；(5)将Cas9 mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；(6)检测突变类型，计算基因编辑率。

技术领域

本发明涉及生物技术、遗传育种领域，尤其是一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用。

背景技术

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲶形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)，是我国重要的淡水经济养殖鱼类之一。由于黄颡鱼雄鱼生长速度是雌鱼的2-3倍。近年来国内兴起全雄黄颡鱼养殖，但是随着黄颡鱼养殖业的快速发展，一些问题相继出现，例如，用于生产全雄苗的YY超雄鱼供应紧张，价格昂贵；另外由于近亲繁殖现象严重，导致黄颡鱼种质退化、生长速度降低、抗病抗逆性降低等。这严重制约了黄颡鱼养殖业的可持续发展，因此迫切的需要对黄颡鱼现有的种质进行提纯复壮，选育出遗传性状优良的纯系超雄鱼和全雌鱼。

理解黄颡鱼性别决定和分化以及生殖调控机制是进行人工性别控制育种的基础。Dmrt(Doble-sex and Mab-3 relatated transcription factor)基因家族包含了果蝇的性别决定基因Dsx和线虫的性别决定基因Mab-3的共有序列，其编码的蛋白质具有锌指状DNA结合基序(DM结构域)，DM结构域是脊椎动物性别决定通路的一个古老而保守的组成部分。目前在哺乳类、鸟类、鱼类、爬行类和两栖类的多个物种中共发现了至少8种Dmrt基因家族成员，dmrt1是其中被研究的最多且最具代表性的基因，其在性别的分化和发育过程中发挥重要作用。

基因编辑技术是生命科学领域的一项重要技术手段，它通过对特定目的基因的基因组序列进行编辑，加速了基因功能的研究、疾病的研究与治疗以及药物的开发等。目前常用的基因编辑技术主要包括锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术和基于规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)系统核酸酶技术。前两种技术对DNA序列的识别依赖于其中的DNA结合蛋白模块，设计相对繁琐易错、费时且价格昂贵。CRISPR技术通过引导RNA(gRNA)介导对DNA的识别，设计简单、高效且价格低廉，在多个物种中得到广泛应用。

黄颡鱼dmrt1基因全长18952bp，包含5个外显子和4个内含子，如何选择合适的靶点，使整个基因失去功能并且出现易于筛选的表型是成功获得突变体的关键。传统的单一靶点敲除，打靶效率较低，DNA自主修复不确定性高容易造成无义突变，而且几个碱基的缺失不容易鉴定，往往需要花费大量的资金进行测序鉴定。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的之一在于提供一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统，以获得编辑效率高且易于筛选的突变体，用于研究dmrt1基因对黄颡鱼性别决定和分化的作用，以及解决通过基因组编辑培育黄颡鱼新种质的问题。