[发明专利]一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法

权利要求书

1.一种粪便中血吸虫DNA提取方法，所述方法为：

（1）取感染血吸虫的动物粪便置于小烧杯中，加入RO水，玻璃棒搅拌均匀；

（2）用100目和180目铜筛网过滤，反复冲洗后收集180目铜筛网上的粪便于量杯中，注满生理盐水，室温下静置，弃上清，取沉淀涂片计数虫卵；

（3）将沉淀转移至小研钵中，倒入少量液氮冷冻，待液氮挥发完以后，进行研磨，反复倒入液氮冷冻研磨，如此反复三次；将研磨后显微镜下观察有无完整虫卵，如有继续研磨；

（4）将研磨后粉末仔细刮入1.5mlEP管中，加蛋白酶K，混匀将研磨后粉末仔细刮入1.5mlEP管中，加蛋白酶K，混匀；

（5）加入缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置；

（6）加入无水乙醇，充分震荡颠倒混匀，此时会出现絮状沉淀，瞬离取出管盖内壁水珠；

（7）将上述液体和絮状物转移至吸附柱中，吸附柱放入收集管中，离心，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

（8）向吸附柱加入漂洗液PW，离心，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤两次；

（9）将吸附柱放入收集管中，离心，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

（10）将吸附柱转移至一个新的1.5mlEP管中，向吸附膜中央悬空滴加洗脱液TE，室温放置，离心，吸附柱弃掉，盖上EP管，做好标记，放入-20℃冰箱保存。

2.一种基于粪便中分离出的DNA的LF-RPA检测试剂盒，所述试剂盒中包括：

用于检测日本血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TCTACTAAAACCGCGCACTAAGTTGTATATTGG（SEQ ID NO.7），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TTCCTTATTTTCACAAGGTGAAGTCAAGCG（SEQ ID NO.8）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AACGTTCGATCGTTATGTCAAATAGGACAA(THF) AGGCAT CCTTAGCCAT G-C3-spacer（SEQ IDNO.9）；

用于检测曼式血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为AT CTGAAT CCG ACC AAC CGT TCT ATG AAA ATC G（SEQ ID NO.10），下游引物的核苷酸序列为Biotin -ATATTAACGCCCACGCTCTCGCAAATAATCTA AAAC（SEQ ID NO.11）；所述探针的核苷酸序列为 FAM- ACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCT（THF）CGAAACCACTGGACTTTTTATG -C3-spacer（SEQ ID NO.12）；

用于检测东毕吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TTTAGCTTGGAGTATAGTGGTATGTCTTTTTTAG（SEQ ID NO.13），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TATATTTGGTTTCCTTTGCTATAAACCAAAGG（SEQ ID NO.14）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AATGATGTTTGTCTTTAGTTGGTTGTCTTC (THF) ATTATTTTTATTAGTAGGTTC3-spacer（SEQ IDNO.15）。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成成分：LF-RPA引物探针混合液，LF-RPA反应预混液，PCRD试纸条和PCRD试纸条缓冲液PCRDextraction buffer；所述LF-RPA引物探针混合液中，引物的核苷酸序列如权利要求1中所述，探针的核苷酸序列为权利要求1所述。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒在检测、鉴定日本血吸虫，曼式血吸虫，东毕吸虫中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：

1)对待检测核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；

扩增时所使用的引物对和探针为：

用于检测日本血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TCTACTAAAACCGCGCACTAAGTTGTATATTGG（SEQ ID NO.7），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TTCCTTATTTTCACAAGGTGAAGTCAAGCG（SEQ ID NO.8）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AACGTTCGATCGTTATGTCAAATAGGACAA(THF) AGGCAT CCTTAGCCAT G-C3-spacer（SEQ IDNO.9）；

用于检测曼式血吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为AT CTGAAT CCG ACC AAC CGT TCT ATG AAA ATC G（SEQ ID NO.10），下游引物的核苷酸序列为Biotin -ATATTAACGCCCACGCTCTCGCAAATAATCTA AAAC（SEQ ID NO.11）；所述探针的核苷酸序列为 FAM- ACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCT（THF）CGAAACCACTGGACTTTTTATG -C3-spacer（SEQ ID NO.12）；

用于检测东毕吸虫的引物对和探针，所述引物对上游引物的核苷酸序列为TTTAGCTTGGAGTATAGTGGTATGTCTTTTTTAG（SEQ ID NO.13），下游引物的核苷酸序列为Biotin-TATATTTGGTTTCCTTTGCTATAAACCAAAGG（SEQ ID NO.14）；所述探针的核苷酸序列为 FAM-AATGATGTTTGTCTTTAGTTGGTTGTCTTC (THF) ATTATTTTTATTAGTAGGTTC3-spacer（SEQ IDNO.15） ；

2) 将待检测核酸样品，LF-RPA引物探针混合液，缓冲液、醋酸镁溶液等混于反应管中；将RPA反应体系缓慢涡旋混匀，放置与37℃水浴锅中充分反应20min，在冰上停止反应；将LF-RPA扩增产物移取2μl到灭菌离心管中，加入98μl的运行缓冲液，充分涡旋混匀后，将10μl样品稀释液滴加至侧流层析免疫试纸条末端，并将侧流层析试纸条迅速转移到含有200μl反应缓冲液的1.5mlEP管中，室温孵育5-10min，观察结果；如果试纸条同时出现检测线和控制线，表明该粪样含有相应的血吸虫DNA；如果试纸条只出现控制线，则该粪样不含对应的血吸虫DNA；同时阴性对照试纸条只出现控制线，不出现检测线。