[发明专利]一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF-RPA方法

说明书

本发明公开了一种粪便中血吸虫DNA提取方法及其快速鉴定LF‑RPA方法。本发明的方法通过提取寄生虫虫卵DNA进行诊断，检测结果可以被未经任何训练的非专业人员肉眼所识别，有利于基层单位或边远区落后地方的推广使用，建立起来的诊断方法具有良好的敏感性，特异性，且能够区分日本血吸虫、曼氏血吸虫和东毕血吸虫，对于低强度感染的诊断具备优势，对于防治血吸虫等吸虫的感染具有重大的意义。

技术领域

本发明涉及寄生虫检测技术领域，具体涉及一种从粪便中提取血吸虫DNA的方法，并针对获得的DNA进行快速鉴定的LF-RPA方法及其应用。

背景技术

血吸虫病是人类最古老的的寄生虫病之一，近年来在控制血吸虫病方面的进展依然缓慢。血吸虫病传统的诊断法包括病原学诊断法和免疫学诊断法。病原学诊断法，如粪检法，毛蚴孵化法等，病原检查检出率低，感染往往需要到达一定使其才能从粪便中孵化出毛蚴或收集到虫卵，且较低度的感染往往很难检查出来，具有较高的漏检率，一个检测耗时4-5h，耗时较长，相对不敏感，不能满足我国低流行区的要求。免疫学诊断法如IHA,ELISA法，也是常用的诊断方法，利用抗原抗体高效特异性的结合，从而检测分析样品中的目标物质，其中的目标物质可以是抗原，抗体，免疫细胞及其分泌的细胞因子，可以对他们进行定性或定量分析。灵敏度较病原学诊断较高，减少了一定的漏检率，相对病原学法简便且快速，具有特异性高，灵敏性强，反应迅速，操作简单的等优点，但是其一般难以区分治疗前后，治疗后动物体内抗体水平依旧居高不下，以IHA法和ELISA检测，容易反复诊断阳性导致重复治疗，且和其他寄生虫诊断具有较高的交叉反应性。

随着分子生物学的快速发展，越来越多的分子生物学检测技术相继被科研工作者开发并应用，分子生物学检测技术是基于特定生物大分子（核酸，蛋白质）的扩增，目前血吸虫病的分子生物学诊断已经相对研究透彻，能从多种多样的样本如，血清，粪便，虫体等检测血吸虫的DNA，虽然研究表明他们是灵敏且可靠的，但是，由于仪器设备和PCR所需环境要求较高等原因，这些PCR技术仅限于实验室，因此需要建立一种灵敏的，特异性高的，使用方便快速的现场诊断方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本文结合LF-RPA技术，建立从粪便抽提DNA进行的寄生虫病诊断，设置虫卵DNA为对照，对比两种来源的模板DNA进行的LF-RPA检测的敏感性和特异性的差异，建立以粪便抽提的DNA为模板的LF-RPA检测技术。

具体的，本发明提供一种从粪便中抽提血吸虫DNA的方法，所述方法为：

（1）取感染血吸虫的动物粪便置于小烧杯中，加入RO水，玻璃棒搅拌均匀。

（2）用100目和180目铜筛网过滤，反复冲洗后收集180目铜筛网上的粪便于量杯中，注满生理盐水，室温下静置，弃上清，取沉淀涂片计数虫卵。

（3）将沉淀转移至小研钵中，倒入少量液氮冷冻，待液氮挥发完以后，进行研磨，反复倒入液氮冷冻研磨，如此反复三次；将研磨后显微镜下观察有无完整虫卵，如有继续研磨。

（4）将研磨后粉末仔细刮入1.5mlEP管中，加蛋白酶K，混匀将研磨后粉末仔细刮入1.5mlEP管中，加蛋白酶K，混匀。

（5）加入缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置。

（6）加入无水乙醇，充分震荡颠倒混匀，此时会出现絮状沉淀，瞬离取出管盖内壁水珠。

（7）将上述液体和絮状物转移至吸附柱中，吸附柱放入收集管中，离心，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

（8）向吸附柱加入漂洗液PW，离心，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤两次。

（9）将吸附柱放入收集管中，离心，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。