[发明专利]一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法

权利要求书

1.一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)构建野生型抗体scFv质粒模板：将抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接后，利用限制性内切酶位点接入大肠杆菌表达载体，获得完整的scFv质粒模板，方便对可变区序列的改造；

(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变，通过PCR的方法，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸，然后用限制性内切酶消化质粒模板，获得突变后的PCR产物转化大肠杆菌，用诱导剂诱导后获得可溶性scFv抗体；

(3)建立Capture-ELISA条件并进行高通量筛选：

首先，包被不同浓度的anti-c-Myc抗体，c-Myc标签存在于scFv抗体上，加入诱导后的突变体表达上清，用不同的缓冲溶液调整pH，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，孵育，使可溶性scFv抗体片段定量地捕获在ELISA板上；

然后加入不同浓度的带有标签的抗原，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，再孵育；

然后加入检测抗原标签的二抗，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，测得抗原-抗体结合的亲和力信号；

筛选的要求为：保证大肠杆菌表达的未经纯化的抗体在实验中保持pH稳定且不受细菌培养液和分泌物影响；筛选出的条件包括：包被抗体浓度，缓冲液pH和盐浓度，抗原浓度；

(4)KD-ELISA和FACS检测：对样品进行梯度稀释后，用不同pH buffer进行KD-ELISA和FACS的检测，根据检测数据绘制的曲线，确认目标克隆在抗原表面和细胞表面靶点的pH依赖结合活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述限制性内切酶为DpnI限制性内切酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述标签为Fc标签。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述标签为mFc或hFc标签。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述大肠杆菌为BL21大肠杆菌。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：后续利用筛选出的条件，对诱导后的突变体上清进行筛选。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：采用Capture-ELISA对诱导后的突变体表达上清进行相对定量检测。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：根据筛选出的条件进行标签抗体包被和筛选，获得具有pH依赖结合信号的单点突变克隆；选取对pH敏感的突变点，再进行组合突变，随后利用Capture-ELISA进行再次筛选，获得最终的具有pH依赖结合活性，且抗原-抗体亲和力没有明显降低的克隆。