[发明专利]一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法

说明书

本发明公开一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，包括步骤：(1)构建野生型抗体scFv质粒模板；(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸；(3)建立Capture‑ELISA条件并进行高通量筛选；(4)KD‑ELISA和FACS检测：对样品进行梯度稀释后，用不同pH buffer进行KD‑ELISA的检测，根据检测数据绘制的曲线，确认目标克隆在抗原表面和细胞表面靶点的pH依赖结合活性。本发明提供的方法能够高通量、高效率、低成本的获得pH依赖结合活性的抗体。

技术领域

本发明涉及抗体的工程改造，具体涉及一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法。

背景技术

单克隆抗体广泛用于疾病治疗。传统的抗体与抗原的结合是没有条件依赖的，例如在一定的pH范围内抗体表现相同的抗原结合活性。而通过抗体工程手段引入pH依赖活性有很高的应用价值。不具有pH依赖活性的抗体与抗原结合后，通过“缓冲”作用延长目标抗原的半衰期，不能将抗原从血浆中清除，反而增加了血浆中抗原的浓度。而一些天然的受体不仅能与配体结合，还能在酸性核内体(～pH 5.5)的pH依赖性解离，不断地从血浆中清除配体，随后受体循环到细胞表面再利用。据此可以改造抗体，使其在酸性核内体pH值时亲和力弱，但在中性pH值附近与靶标结合具有较高的亲和力。这样的抗体在细胞核内体内释放抗原走降解通路，抗体可以回收到细胞表面再利用。例如针对IL-6R和PCSK9的抗体，研究者们通过组氨酸突变的方法获得了具有pH敏感性结合的抗体，可以降低抗体的清除，增加体内PK和药效。

另外，为了得到专门针对肿瘤的微酸微环境中特异结合靶标的抗体，则需要改造抗体，使其在微酸环境下结合远远强于在中性pH下的结合，以达到肿瘤特异结合和降低毒性的作用，从而使抗体能在更低剂量下达到与传统抗体相似的疗效。但是，由于肿瘤的微酸环境的pH大约为6.5，与中性pH7.4的差别小于1，常规筛选方法的灵敏度难以达到要求。因此，本领域需要更灵敏的一套方法来做筛选和区分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，能够高通量高、高效率、低成本的获得pH依赖结合活性的抗体。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，包括步骤：

(1)构建野生型抗体scFv质粒模板：将抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接后，利用限制性内切酶位点接入大肠杆菌表达载体，获得完整的scFv质粒模板，方便对可变区序列的改造；

(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变，通过PCR的方法，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸，然后用限制性内切酶消化质粒模板，获得突变后的PCR产物转化大肠杆菌，用诱导剂诱导后获得可溶性scFv抗体；

(3)建立Capture-ELISA条件并进行高通量筛选：

首先，包被不同浓度的anti-c-Myc抗体，加入诱导后的突变体表达上清，用不同的缓冲溶液调整pH，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，孵育，使可溶性scFv抗体片段定量地捕获在ELISA板上；

然后加入不同浓度的带有标签的抗原，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，再孵育；

然后加入检测抗原标签的二抗，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在不同的pH条件下进行筛选，测得抗原-抗体结合的亲和力信号；

筛选的要求为：保证大肠杆菌表达的未经纯化的抗体在实验中保持pH稳定且不受细菌培养液和分泌物影响；筛选出的条件包括：包被抗体浓度，缓冲液pH和盐浓度，抗原浓度；