[发明专利]一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法

说明书

本发明公开了一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法，包括如下步骤：(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心取上清；萃取，旋蒸，得黄色粘稠物；(2)将黄色粘稠物经大孔树脂层析，用甲醇水溶液洗脱，得到Fr.1‑Fr.3组分；(3)将组分Fr.2和Fr.3合并后使用硅胶柱柱层析，用三氯甲烷：甲醇体系洗脱，共得到Fc.1‑Fc.20；(4)将Fc.17‑Fc.19合并浓缩分离，收集T1；(5)T1冷冻干燥，得到环已酰亚胺固体。本发明发现了解淀粉芽孢杆菌次级代谢产物中存在环已酰亚胺；并且使用大孔树脂对环已酰亚胺进行分离提纯，降低了成本，提高了效率；环已酰亚胺的提取率为65％以上，纯度为91％以上。

技术领域

本发明涉及一种从细菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺的方法，具体地说涉及一种从解淀粉芽孢杆菌分离提纯环已酰亚胺的方法。

背景技术

海洋生物活性次级代谢产物是新药的重要来源之一，具有结构特异性高、种类繁多且生物活性较强等特点。此外，在化工、医药、食品等领域，海洋次级代谢产物也都具有广阔的应用前景。目前，已从海洋微生物中分离到多种活性物质，如生物碱类、环肽、大环内酯类、萜类、甾醇类、醌类、吩嗪类等化合物。这些代谢物为药物研究提供了重要的前体化合物。应用海洋来源的芽孢杆菌进行植物病害生物防治已早有报道。研究显示，解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用。然而其主要活性物质分离鲜有报道。

环已酰亚胺结构简单，水溶性好，并且能抑制多种病原菌的生长，进而备受关注。现有研究多集中在环已酰亚胺及其结构类似物的合成与分离上。目前环已酰亚胺提取方法主要包括：萃取、Sephadex柱层析、硅胶柱层析、制备液相分离等四个步骤。现有分离方法存在诸多缺陷如，1)层析中所用的葡聚糖凝胶树脂LH-20原料成本高；2)产品收率低，过程损失达70％；3)产物纯度低，不超过80％。利用微生物生产抗生素类产品历史悠久，如青霉素的发酵生产，其可以极大的提高产量，建立相应的分离提纯方法可降低成本。然而，应用上述分离方法对发酵液中的环已酰亚胺进行分离提纯的研究较少，距工业化应用仍有较大差距。因此开展发酵液中高纯度环已酰亚胺提取分离研究，并建立相关分离工艺，具有巨大的应用价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中分离提纯环已酰亚胺方法，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心取上清液；用等体积乙酸乙酯萃取，萃取重复2-3次，得乙酸乙酯萃取液；合并，44℃旋蒸，除去乙酸乙酯，得黄色粘稠物；

(2)将所述黄色粘稠物经型号D101大孔树脂层析，依次用体积浓度为50％，60％，70％的甲醇水溶液进行洗脱，每个梯度使用4倍柱体积洗脱剂，得到Fr.1、Fr.2、Fr.3组分；

(3)将200-300目柱层析用硅胶粉用乙酸乙酯浸泡24-28h，装填在硅胶柱中；将组分Fr.2和Fr.3合并后使用硅胶柱柱层析，依次用体积比为(50：1)，(20：1)，(15：1)，(10：1)的三氯甲烷：甲醇体系洗脱，每个梯度使用3倍柱体积洗脱剂，每个梯度依次收集5份洗脱剂，共得到20个组分，依次为Fc.1～Fc.20；

(4)将Fc.17、Fc.18和Fc.19合并浓缩，通过高效制备液相进行分离，检测器为视差检测器，收集RT＝14min的组分为T1；

(5)将T1在-75℃～-81℃冷冻，再用冷冻干燥机冷冻干燥，得到环已酰亚胺固体。

优选地，解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensLWYZ003，保藏编号：CGMCC NO.18345，还可以选用其它的解淀粉芽孢杆菌。

本发明的优点：