[发明专利]石龙芮体细胞胚诱导方法与体细胞胚介导的遗传转化方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及石龙芮体细胞胚诱导方法与体细胞胚介导遗传转化的方法。本发明的石龙芮体细胞胚诱导方法包括：石龙芮无菌苗的培养；体细胞胚诱导培养基SE‑M于暗培养条件下诱导石龙芮根、茎(无腋芽)和叶产生体细胞胚；体细胞胚于生根培养基RO‑M上诱导生根、成苗等步骤。本发明可为石龙芮体细胞胚发生的分子机制研究，石龙芮抗逆与土壤修复新种资创制等提供稳定的受体系统和验证平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及石龙芮体细胞胚诱导方法与体细胞胚介导遗传转化的方法。

背景技术

石龙芮是一种毛茛科中草药，富含药用价值较高的次生代谢物，包括生物碱、单宁、黄酮类化合物、异黄酮和原儿茶醛。长期以来，石龙芮一直被中国传统医学用来防止乙型肝炎病毒HBV和单纯疱疹病毒1型HSV-1的复制，其还可用于治疗黄疸、风湿性疼痛、哮喘和小便失禁。同时，石龙芮也是控制黑腹果蝇和赤拟谷盗等害虫非常有效的杀虫剂。此外，石龙芮具有较强的污水处理能力，能吸收大量氮、磷，积累和监测土壤中重金属的含量变化，如铜、铅、铁、锌等。

现有技术对毛茛科植物的研究多集中于该科植物的次生代谢物质的活性检测、毒性与活性成分组分分析，土壤重金属与有机污染物的清除与净化，以及二倍体黑种草、耧斗菜等观赏性毛茛科植物花器官的发育机制等方面。多种毛茛科植物的常规无菌苗培养过程尚且存在一些技术难度，如种子萌发率、发芽势的同步率、无菌苗的继代培养等。关于毛茛科植物体细胞胚发生及其介导的高效再生、常规再生体系以及遗传转化体系均无可参考的现行体系。石龙芮体细胞胚介导的高效再生与遗传转化等体系建立存在诸多技术瓶颈：如培养基筛选、种子催芽、植物生长调节剂种类与浓度筛选、最佳外植体的筛选以及农杆菌侵染时段的选择等。因此，石龙芮体细胞胚介导的高效再生与遗传转化体系方面未有研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供石龙芮体细胞胚诱导方法。

本发明的再一目的在于提供石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚诱导方法，包括以下步骤：

(1)将石龙芮种子消毒，播于无菌苗(MS)培养基中，进行无菌苗培养；

(2)选择无菌苗的营养器官为外植体，置于体细胞胚诱导培养基上，进行体细胞胚结构的诱导，其中，体细胞胚诱导培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、10.0mg/L NAA、30g/L蔗糖、3.6g/L结冷胶，体细胞胚诱导培养基的pH为5.8；

(3)将诱导出的石龙芮体细胞胚转入生根培养基，进行垂直板培养，诱导胚体生根，其中，生根培养基包括以下组分：1/2MS盐、1/2B5有机、0.1mg/L NAA、15g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，生根培养基的pH为5.8；

(4)炼苗、移栽。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚诱导方法，步骤(1)中，选择健康饱满的石龙芮种子，先用体积比为75％乙醇进行表面消毒0.5-1min，无菌水冲洗3-5遍；再用2.5％次氯酸铵消毒处理8-10min，无菌水冲洗3-5遍，对种子进行消毒。

根据本发明具体实施方式的石龙芮细胞胚诱导方法，MS培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，MS培养基的pH为5.8。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚诱导方法，步骤(1)中，种子播于MS培养基后，在4℃条件下催芽2-3d，然后于黑暗、温度为25±1℃条件下，孵育种子，直至种壳露白；然后将培养皿于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m^-2s^-1的条件下进行培养。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚诱导方法，步骤(2)中，选择无菌苗的根、茎或叶做为外植体。