[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；

S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；

S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；

S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；

S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；

S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。

2.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中透析离心设备中安装有透析半透膜，且蛋白质在透析离心设备介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快。

3.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中培养瓶的培养基内含有45-50μl/ml的氨苄青霉素。

4.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中离心分离菌体的时间为8-10分钟，分离温度为2-4℃。

5.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中磷酸缓冲液的pH为7.0，且破碎设备的破碎压强为100-110MPa。

6.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中离心分离的时间为10-15分钟，分离温度为2-4℃。

7.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中离心分离的时间为80-100分钟，分离温度为2-4℃。

8.根据权利要求1所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中葡萄糖脱氢酶进行阳离子交换层析时，首先用缓冲液平衡柱子，吸附样品以后，用柱容量2-5倍量的缓冲液进行冲洗，然后，用NaCl和缓冲液进行线性梯度的洗脱，洗脱出目的酶，流速为0.2-0.5ml/min，在280nm的吸光波长下检测洗脱出的蛋白质，洗脱物每1-2分钟收集一次，在盐浓度为80mM附近时显示出洗脱峰。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：其制备的葡萄糖脱氢酶可应用于生物能源、食品工业、生物化工、生物传感或分析检测中。