[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入，S3、菌的培养，S4、菌体破碎过滤处理，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化，本发明涉及生物工程技术领域。该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用。

背景技术

葡萄糖脱氢酶(GDH)广泛参与生物体中的葡萄糖代谢途径，特别是芽孢杆菌在芽孢形成阶段的关键酶，借助于辅酶NAD(P)+，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成葡萄糖酸内酯，辅酶NAD(P)+则被还原为NAD(P)H，自二十世纪八十年代起，研究人员就已经克隆了来源于芽孢杆菌的GDH，并在大肠杆菌中进行了高效表达，来源于芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶家族，是由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，单体的分子量约为30kDa，野生型的GDH热稳定性和pH稳定性都不理想，因此，在实际应用上受到了一定的限制，鉴于此，研究人员开始对编码GDH的基因进行体外定向进化的研究，DN46在66℃的半衰期为540分钟，而F20仅为1.3分钟。GDH的三维结构研究表明，突变体通过增强疏水作用和减小离子的排斥作用显著增强了亚基与亚基之间的相互作用力，稳定了酶的三维结构，从而提高了酶的稳定性，在底物特异性方面，GDH对其天然底物β-D-葡萄糖的特异性并不高，对结构类似的木糖、半乳糖、甘露糖都有较弱的催化作用。

现有的葡萄糖脱氢酶制备过程中，大多只进行单一的电泳提纯或沉淀提纯，然而，这样的提纯方法提纯效果较差，提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白含量较高，十分不利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，不能实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，无法达到通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，从而给葡萄糖脱氢酶的使用带来极大的不利。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，解决了现有的提纯方法提纯效果较差，提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白含量较高，十分不利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用，不能实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，无法达到通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高目的的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；

S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；

S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；

S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；