[发明专利]乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽及其制备方法

说明书

本发明公开了乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽及其制备方法。本发明通过胃蛋白酶水解乌鳢蛋白，制备了具有高活性的ACE抑制肽的酶解液，利用超滤管粗分，液相色谱进一步分离，鉴定得到三条相应的多肽序列FRVPTPNVS、HVNKDIAPKL和KIKIIAPPERKYS。乌鳢来源广泛且价格便宜，因此本发明不仅降低了制备ACE抑制肽的成本，提升了乌鳢的利用价值，且有望应用于商业化制备降血压药物，促进了淡水鱼资源的深化利用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽及其制备方法。

背景技术

据世界卫生组织报告，世界上大约30％的死亡是由心血管引起的。到2020年，中风和心脏病疾病将是全世界死亡的主要原因。降血压肽通过抑制血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的活性从而降低血压，因此又称为ACE抑制肽。ACE能催化血管紧张素Ι转化为血管紧张素Ⅱ以及使血管扩张剂(缓激肽)失活，因此导致血压升高(Food Chem,2017,228:506–517)。因此，抑制ACE活性已成为治疗高血压的主要目标。尽管一些合成的ACE抑制剂，如依那普利，阿拉西普利或赖诺普利对高血压有疗效，但具有极强的副作用，包括炎症反应、干咳、味觉障碍或血管神经性水肿等。因此，几乎无副作用的食物来源的ACE抑制肽被认为是一种极具潜力的降血压肽。

生物活性多肽是指具有降血压、抗氧化、抗菌和调节免疫等功能的多肽(J FunctFoods,2010,2:1–9)，一般由2-20个氨基酸组成(Food Chemistry,2012,32:1872–1882)。20世纪50年代，美国最先对生物活性多肽进行初步的探索研究，韩国和日本也相继对该领域进行研究。在过去的近30年里，国内外研究者们对于ACE抑制肽的关注度也不断增加。目前许多植物类、动物类以及海洋生物类的食物已经用于制备ACE抑制肽，如大豆、大米、奶酪、牛肉、肌肉、扇贝、金枪鱼等。海洋生物类尤其鱼类蛋白含量高且优质，是一类优质的制备降血压多肽的原料。中国发明专利CN102517364A(公开号)中公布了一种利用海参制备ACE抑制肽的方法，通过膜分离技术得到活性高的小分子ACE抑制肽，药用价值高。中国发明专利CN103571904A(公开号)中公布了一种利用鮰鱼皮制备胶原蛋白肽的方法，利用碱性蛋白酶水解得到ACE抑制肽，效果极好。中国发明专利CN108033995A(申请公开号)中公开了两种来源于大黄鱼肌联蛋白的ACE抑制肽，通过体外验证和分子对接技术证明了两种活性多肽的降血压效果。但目前极少有利用淡水鱼制备ACE抑制肽的研究，对于乌鳢的研究更是少之又少。

发明内容

本发明的目的在于提供由乌鳢蛋白来源的降血压肽及其制备方法。

为了达到以上目的，本发明采用了以下技术方案：

乌鳢蛋白来源的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)原料准备：将新鲜的乌鳢仅保留背部肌肉，去刺去皮，冷却水漂洗1-2次，绞碎，冷冻干燥，磨粉，过40目筛，收集过筛的鱼粉冷藏备用；

(2)乌鳢蛋白酶解液制备：称取0.1-2％(w/v)的鱼粉溶于超纯水中，搅拌过夜，离心取上清即得乌鳢蛋白。将乌鳢蛋白调节至pH＝2-4，加入1-7％的胃蛋白酶，36-38℃下水解4-8 h，水解过程中不断搅拌，水解完成后85-95℃水浴8-10min灭酶。将酶解液与未酶解的蛋白进行ACE抑制活性测定。

(3)首先利用超滤管或超滤膜对酶解液进行粗分，得到分子量为1-3KDa的乌鳢蛋白多肽组分。再将该组分利用反相高效液相色谱进一步分离纯化，按照出峰时间收集多肽，即得到ACE抑制肽。

优选地，步骤(3)中，采用反相液相色谱分离，流速为4mL/min，流动相A-乙腈含0.1％三氟乙酸/B-水含0.1％三氟乙酸为：0-5min，5％A；5-30min，5％-75％A；按照出峰时间收集多肽组分，12-15min收集的多肽组分为最佳的ACE抑制肽组分。