[发明专利]特异性检测样本中HTLV-I前病毒DNA的引物及其应用

说明书

本发明公开了特异性检测HTLV‑I前病毒DNA的引物和荧光探针，以及检测样本中HTLV‑I前病毒DNA的TaqMan qPCR方法，可用于定性或定量检测样本中的感染HTLV‑I细胞中的前病毒DNA。

技术领域

本发明属于分子生物检测领域，更具体涉及对样本中HTLV-I前病毒DNA的检测。

背景技术

人嗜T淋巴病毒I型(HTLV-I)属于逆转录病毒科肿瘤病毒亚科哺乳类C型病毒，又可以分为6种亚型，分别为A～F，电镜下呈球形颗粒，直径约为80～130nm，在20世纪80年代初被美国和日本科学家发现，是最早发现的一种人类逆转录病毒[1]。

人嗜T-淋巴病毒I型感染宿主细胞后，病毒的RNA能够经逆转录合成相应DNA并整合进入宿主基因组DNA形成前病毒(HTLV-I provirus)[2]。该病毒感染的细胞主要是CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞[3]，但在特定条件下可感染非T淋巴细胞，如B淋巴细胞，甚至可感染骨髓干细胞和巨噬细胞[4]。

人嗜T-淋巴病毒I型能引起多种疾病，如成人T细胞白血病(ATL)[5,6]、热带痉挛性下肢瘫(TSP)[7]和多发硬化症(MS)、不明原因的脉管炎(KW)等。有研究认为，HTLV-I相较于其他致癌病毒或致癌细菌(如EB病毒和幽门螺旋杆菌)具有更强的致癌性[8]。还有一些疾病，如不同的血源性肿瘤、慢性肺炎疾患、风湿性关节炎和某些实质性肿瘤等，很可能也是由于感染HTLV-I病毒后产生的人体免疫抑制所导致的疾病。目前，全球有大于2000万人感染HTLV-I，该病毒伴有较长的潜伏期，发病较为缓慢，约有2-5％的感染者一直会表现出潜伏无症状期。但约0.1-2％的HTLV-I感染者比例将发展为上述临床症状[6]。在细胞培养上，人嗜T-淋巴病毒I型感染可诱导T细胞永生化；人嗜T-淋巴病毒I型感染的脐带T细胞可持续生长并表达DR蛋白，白细胞介素-2受体表达量增加，而对外源性白细胞介素-2的依赖性降低，这些特性与ATL患者的恶性T细胞特性相似。

HTLV-I有两种常见的方法病毒传播方式。一、血液接触传播：输血时HTLV-I可通过被感染T淋巴细胞和巨噬细胞传播到新宿主中[9]。二，母乳喂养传播，HTLV-I能通过母乳传播至婴儿[10]，也有证据表明，将母乳喂养改为配方奶喂养能够有效降低婴儿HTLV-I感染率[11]。目前，尚无有效的HTLV-I治疗方法及抗病毒药物，因此只能通过HTLV-I检测进行必要预防。现有的HTLV-I的检测方法包括外周血或骨髓细胞学检查、血清HTLV-I抗体检测、病毒颗粒及抗原检测和脑脊液检查，例如ELISA(酶联免疫吸附检测)、PA(颗粒凝集)、IF(免疫荧光)、WB(免疫印迹)等血清学诊断，但这些方法有一定的局限性，如不能区分是HTLV-Ⅰ还是HTLV-Ⅱ的感染，操作繁琐，灵敏性和特异性不高，容易出现假阳性。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR，quantitative real time polymerase chainreaction)技术的发展实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且其特异性强、灵敏度高、检测方法简便快速、能有效检测出低拷贝的目的DNA片段，为我们提供了新的检测HTLV-I手段。应用实时荧光定量PCR技术并设计针对整合于宿主基因组中的HTLV-I前病毒DNA片段的特异引物、探针，理论上能够大大提高检测样本中HTLV-I的灵敏性和特异性，避免目前已有的HTLV-I检测手段的不足之处。