[发明专利]一种水体粪便污染检测的引物、试剂盒及高通量溯源方法

权利要求书

1.一种水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述方法具体步骤为：

(a)样品处理：取待测水样，针对水样中的DNA进行提取；

(b)巢式PCR扩增：利用水体粪便污染检测的引物针对步骤(a)中提取的DNA进行巢式PCR扩增，得到巢式PCR产物；所述引物为巢式PCR扩增序列，所述序列分别为：

AF(5’-3’):ACTGGGATTAGATACCCCACTATG；

AR(5’-3’):ACCAGCTATCACCMRGCTC；

BF(5’-3’):CCCACTATGCYTRGCCCTAAA；

BR(5’-3’):GTAYRCTTACCWTGTTACGACTT；

(c)高通量测序：将巢式PCR产物切胶回收纯化后进行高通量测序，测序结果以.fastq格式输出，过滤测序长度短的序列；

(d)污染源解析：将步骤(c)中得到序列与线粒体DNA数据库进行BLAST比对，依据BLAST注释信息进行污染源解析。

2.根据权利要求1所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(b)中的巢式PCR过程为：先用AF、AR进行第一轮PCR扩增，模板为水样DNA，扩增条件为：95℃，预变性5min；95℃30s，59℃60s，72℃45s，35个循环；72℃7min，4℃保存；再用BF、BR进行第二轮PCR扩增，模板为第一轮PCR产物，扩增条件为：95℃，预变性5min；95℃30s，58℃40s，72℃45s，35个循环；72℃7min，4℃保存。

3.根据权利要求2所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(c)中切取500bp处的产物进行纯化，高通量测序后过滤掉长度小于450bp的序列。

4.根据权利要求1所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(d)中的线粒体DNA数据库为线粒体12S rRNA基因库。

5.根据权利要求1所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述BLAST注释阈值为0.8。

6.根据权利要求5所述的水体粪便污染检测的高通量溯源方法，其特征在于：所述步骤(d)中以BLAST返回的物种作为潜在粪便污染源，当返回的物种数大于等于2时，各物种注释上的序列数占总序列的比例与各来源粪便污染程度呈正相关。