[发明专利]一种水体粪便污染检测的引物、试剂盒及高通量溯源方法

说明书

本发明公开了一种水体粪便污染检测的引物、试剂盒及高通量溯源方法，检测范围涵盖人类、畜禽类及多种野生动物类粪便污染，属于水体污染检测领域。其主要包括以下步骤：提取待测水样DNA；利用两对扩增线粒体DNA的通用引物对水样DNA进行巢式PCR扩增；将扩增产物进行高通量测序；将测序数据与线粒体DNA数据库进行比对注释，基于比对结果确定水样中存在的粪便污染来源。本发明利用巢式PCR技术对水样中指示粪便污染的线粒体DNA进行扩增，具有极高的灵敏性，采用本发明的通用引物结合高通量测序，不仅能够同时对多种潜在粪便污染进行定性溯源，还能对各类粪便污染的程度进行相对定量，从而确定主要污染源。

技术领域

本发明涉及一种水体粪便污染快速溯源方法，更具体地说，是一种以动物粪便中携带的线粒体DNA为标志物，采用巢式PCR技术与高通量测序技术相结合，同时对多种潜在粪便污染进行筛查的方法。

背景技术

近年来，随着人口和经济的不断增长，水污染情况日趋严重，其中粪便污染尤为突出。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成水体富营养化，而且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播。因此进行水体粪便污染防治刻不容缓。

粪便污染的潜在污染源种类繁多，包括人类生活污水、畜禽养殖废水、宠物以及野生动物排泄物等，这些污染物由于缺乏适当的处理，常常被直接排放到环境中，造成水体粪便污染。在污染事件不明的情况下，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作只能停留在“见污治污”阶段，这在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分并准确定位水体中的粪便污染源，成为了解决问题的关键。

目前粪便污染溯源通常采用源标志物法，即通过检测水中能够指示粪便来源的标志物对粪便污染进行识别。研究较多的标志物包括化学标志物和微生物标志物，但现存的一些化学及微生物标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。近年来，研究者们发现粪便中存在大量来自脱落肠道细胞的线粒体DNA，由于线粒体DNA特定片段中存在大量单核苷酸多态位点，使得线粒体DNA具有种属特异性，可以通过检测粪便污染水体中的线粒体DNA片段来达到粪便污染溯源的目的。同时线粒体DNA片段中又存在一定量的保守区，使得通过设计PCR通用引物扩增不同物种的线粒体DNA片段成为可能。

经检索，现有技术已有相关的申请案公开，如中国专利申请号为201510300317.1，申请公布日为2015.09.02的申请案的方法公开了一种巢式PCR引物、试剂盒以及采用含有巢式PCR引物的试剂盒检测水体鸭粪污染的方法，其步骤为：(1)提取待测水样DNA；(2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，PCR引物为SDF和SDR；(3)第一轮PCR扩增结束后，取PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为NDF和NDR；(4)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为158bp的条带，若存在，则表明水体受到了鸭粪污染。上述申请案的方法虽然能够对是否存在鸭粪污染进行较为准确的筛查，然而该方法应用范围较窄，无法应用于粪便污染较为复杂的溯源筛查。

中国专利申请号为201510305364.5，申请公布日为2015.08.19的申请案公开了一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法，试剂盒中含有针对于上述污染源设计的特异性引物：引物1～引物6，使用上述混合引物(6种)在同一个PCR体系进行扩增反应，使得PCR反应体系中区猪、狗、鸡三种粪便污染源成为可能，其检测方法如下：提取待测水样DNA，以其为DNA为模板，利用试剂盒中提供的引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg²⁺溶液和ddH₂0进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察，若出现390bp、490bp、和783bp的条带，则分别对应指示水中存在狗、猪、鸡粪便污染。该试剂盒可准确检测到水中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便污染。该申请案的方法虽然能够同时检测三种粪便污染，然而检测范围仍较为有限，对应污染源众多的水体污染无法进行高通量的检测，此外也无法相对定量的区分不同污染源的污染程度大小，限制其在水体粪便领域的检测。