[发明专利]一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法

权利要求书

1.一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

所述207种兽药及添加物为：

(a)磺胺类：磺胺二甲嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺脒、磺胺甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺喹恶啉、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、甲氧苄啶、二甲氧苄啶、酞磺胺噻唑、苯酰磺胺、乙酰磺胺、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶；

(b)氟喹诺酮类：洛美沙星、马波沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、恶喹酸、吡哌酸、培氟沙星、西诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星；

(c)苯并咪唑类：甲苯达唑、氨基甲苯哒唑、2-氨基氟苯咪唑、奥芬达唑、奥苯达唑、帕苯咪唑、5-羟基噻苯达唑、噻苯达唑、阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑氨基砜、苯并咪唑、非班太尔、洛苯达唑；

(d)兴奋剂类：赛庚啶、非诺特罗、拉贝特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、莱克多巴胺、沙丁胺醇、沙美特罗、特布他林、马布特罗、妥布特罗、班布特罗、溴布特罗、西马特罗、西布特罗、克伦特罗、克伦丙罗、可乐定；

(e)激素类：醋酸氯地孕酮、17a-甲基睾丸酮、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯、皮质酮、氢化可的松、醋酸可的松、可的松、地夫可特、地塞米松、二氟拉松双醋酸酯、表睾酮、苯甲酸雌二醇、醋酸氟氢可的松、特戊酸氟米松、双氟美松、氟轻松、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松丙酸酯、丙酸诺龙、哈西奈德、己烷雌酚、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮、美雄酮、甲基泼尼松龙、炔诺酮、诺龙、炔诺孕酮、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、黄体酮、去氢睾酮、睾丸酮、群勃龙、曲安奈德、倍氯米松、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松；

(f)硝基咪唑类:地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、奥硝唑、羟基地美硝唑、罗硝唑、塞克硝唑、替硝唑；

(g)抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺；

(h)林可胺类：克林霉素、林可霉素；

(i)酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素；

(j)青霉素类：头孢噻呋、氟氯西林、氯唑西林、萘夫西林、哌拉西林、青霉素G；

(k)喹噁啉类：喹烯酮；

(l)解热镇痛类：非那西丁、水杨酸、氨基比林、安替比林、氨苯砜、氟尼辛葡甲胺、对乙酰氨基酚；

(m)精神类：氟哌啶醇、丙咪嗪、硝西泮、奥沙西泮、匹莫林、奋乃静、异丙嗪、盐酸丙酰丙嗪、舒必利、甲苯噻嗪、乙酰丙嗪、阿扎哌醇、阿扎哌隆、卡马西平、氯丙嗪、地西泮、苯海拉明、氟哌利多、艾司唑仑、克拉霉素、泰妙菌素、红霉素、吉他霉素、替米考星、泰乐菌素；

(n)驱虫类：托曲珠利亚砜、氯羟吡啶、二硝托胺、常山酮、左旋咪唑；

(o)农药类：噻嗪酮、萎锈灵、3-羟基呋喃丹、噻虫胺、环丙氨嗪、敌草隆、乙氧酰胺苯甲酯、氟虫睛、氟啶草酮、乙酰甲胺磷、环嗪酮、抑霉唑、吡虫啉、利谷隆、嗪草酮、腈菌唑、啶虫脒、氟草敏、炔苯酰草胺、莠去津、西玛津、去乙基锈去津、嘧菌酯、解草嗪；

(p)其它类：东莨菪碱、沃尼妙林、阿托品；

(1)标准工作溶液的配制：

a)标准储备液的配制：取各标准对照品10mg，精密称定，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液；其中，诺氟沙星用水溶解，农药类均用丙酮溶解，二甲氧苄啶、阿苯达唑、阿苯达唑砜、非班太尔均用甲酸溶解，然后再用甲醇定容至刻度，对于其他难溶物质，利用甲醇与氨水的混合溶剂或甲醇与二甲基亚砜的混合溶剂进行溶解后，再用甲醇定容至刻度；

b)标准工作液的配制：①准确移取标准储备液各100μL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按药物类别分组如表1所示，配制成16个浓度为10μg/mL的混合标准中间液Ⅰ，分别准确移取混合标准中间液Ⅰ各100μL，用甲醇定容至10mL，配制成浓度为100ng/mL的混合标准中间溶液Ⅱ；②准确移取混合标准中间液Ⅱ100μL、500μL、1mL、5mL，分别用20％甲醇水溶液定容至10mL，配制成浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的混合标准工作溶液；

(2)待测样品的前处理：

a)提取：

对于试样为肌肉或禽蛋：称取试样5g于50mL离心管中，加入提取液，涡旋混匀后，振荡、离心，转移上清液于另一50mL离心管中，残渣用提取液重复提取，合并两次提取的上清液，上清液加入6g无水硫酸钠和1.5g氯化钠，涡旋，静置后离心，得到二次上清液备用，其提取液为3.0mL Mcllvaine-Na₂EDTA缓冲溶液和10mL乙腈的混合溶液，Mcllvaine-Na₂EDTA缓冲溶液中EDTA的浓度为0.1mol/L；

对于试样为牛奶或羊奶：称取试样5g于50mL离心管中，加入提取液，涡旋混匀后，振荡、离心，转移上清液于另一50mL离心管中，上清液加入4g无水硫酸钠和1g氯化钠，涡旋，静置后离心，得到二次上清液备用，其提取液为20mL乙腈；

b)净化：

固相萃取柱依次用4mL甲醇和4mL水活化平衡后，先取2mL二次上清液润洗固相萃取柱，弃去流出液，再移取5mL二次上清液通过固相萃取柱，用离心管收集流出液；准确移取流出液4mL，40℃下氮吹干，加入200μL甲醇后涡旋混匀，再加入800μL纯水涡旋混匀，过0.22μm尼龙滤膜，备用；净化所用固相萃取柱为HyperSep Retain PEP小柱；

(3)高分辨质谱数据库的建立：

将207种兽药及添加物按类别将药物分成16组，分组情况如表1所示，每组混合标准液浓度为1μg/mL，用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对混合标准液进行正负模式下的全扫描和二级扫描，通过分析得到各化合物的保留时间、母离子精确分子量、加合方式、二级碎片离子和同位素丰度比、三个碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV下叠加的二级谱图，完成质谱数据库的构建，如表1所示；其中同分异构体通过进单标进行确认；

表1化合物质谱库信息

液相色谱的条件为：

色谱柱：C18，150mm×3.0mm，粒径1.8μm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；

流动相：A：正离子模式，含0.1％甲酸的水溶液，负离子模式，含0.03％氨水的水溶液；流动相B：正离子模式，含0.1％甲酸的乙腈溶液，负离子模式，含0.03％氨水的乙腈溶液，正离子模式梯度洗脱程序见表2，负离子模式梯度洗脱程序见表3；

表2正离子模式流动相梯度洗脱程序

表3负离子模式流动相梯度洗脱程序

质谱的条件为：

离子源：电喷雾离子源：ESI+和ESI-；

扫描方式：全扫描加自动触发二级扫描模式；

毛细管电压：3.2kv/ESI+、2.8kv/ESI-；

离子传输管温度：325℃；

雾化气温度：350℃；

鞘气压：40arb；

辅助气压：40arb；

一级质谱驻留时间：100ms；

二级质谱驻留时间：60ms；

扫描质量范围：50～1000m/z；

碰撞能量：20、40、60eV；

(4)化合物检测：

用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对前处理后的样品进行检测，得到样品检测原始数据；

液相色谱的条件为：

色谱柱：C18，150mm×3.0mm，粒径1.8μm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；

流动相：A：正离子模式，含0.1％甲酸的水溶液，负离子模式，含0.03％氨水的水溶液；流动相B：正离子模式，含0.1％甲酸的乙腈溶液，负离子模式，含0.03％氨水的乙腈溶液，正离子模式梯度洗脱程序见表2，负离子模式梯度洗脱程序见表3；

质谱的条件为：

离子源：电喷雾离子源：ESI+和ESI-；

扫描方式：全扫描加自动触发二级扫描模式；

毛细管电压：3.2kv/ESI+、2.8kv/ESI-；

离子传输管温度：325℃；

雾化气温度：350℃；

鞘气压：40arb；

辅助气压：40arb；

一级质谱驻留时间：100ms；

二级质谱驻留时间：60ms；

扫描质量范围：50～1000m/z；

碰撞能量：20、40、60eV；

(5)化合物筛查：

样品检测原始数据在5ppm质量窗口范围内进行提取，当化合物同时满足以下条件时得到该样品中测得的疑似阳性化合物：

①目标物信号响应S/N3；

②目标物保留时间与质谱数据库中的保留时间参数偏差±2.5％以内且不超过0.5min；

③目标物和高分辨质谱数据库相比，匹配上一级母离子和一个二级碎片离子，且一级母离子质量精度偏差5ppm，二级碎片离子质量精度偏差10ppm；

(6)化合物确证：

对于样品中的疑似阳性化合物，将其二级碎片谱图与标准溶液中该化合物的二级碎片谱图进行比较，若两张谱图中主要碎片离子的准确分子量精度偏差小于10ppm且相对离子丰度一致，则判定该化合物在该样品中为阳性。

2.如权利要求1所述的动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法，其特征在于：所述步骤(2)中，振荡、离心的条件均为：振荡频率为6000rpm，振荡的时间为10min，离心的转速为4000～7000r/min，离心时间为5min。