[发明专利]基于双重链置换和三向DNA结构检测妥布霉素的比色方法

说明书

基于双重链置换和三向DNA结构检测妥布霉素的比色方法，属于食品安全、医药分析及环境污染检测领域。本发明首先设计了双链T1/T2；当存在妥布霉素时，Bsm DNA聚合酶通过强链置换反应合成完全互补的双链，Nt.BstNBI切刻内切酶切割双链上的识别位点；三向DNA结构捕捉报告探针，再生并置换出大量含有G‑四链体形成序列的S1链。此后，G‑四链体/血红素催化ABTS^2‑/H₂O₂显色反应，利用吸光值与妥布霉素浓度间的线性关系可测定妥布霉素含量。本发明通过适配体捕获妥布霉素触发Nt.BstNBI切刻内切酶和Bsm DNA聚合酶介导的双重链置换反应产生大量的报告探针，同时，报告探针触发λ核酸外切酶辅助的环路扩增，实现了比色信号的多重放大，拓宽了检测范围，提高了检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种基于双重链置换和三向DNA结构检测妥布霉素的比色方法，属于食品安全、医药分析及环境污染检测领域。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是由两个或多个通过糖苷键与己糖环连接的氨基糖组成的抗生素，对常见的细菌性疾病具有良好的治疗效果。妥布霉素是一种广谱氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗某些革兰氏阳性和好氧革兰氏阴性微生物引起的感染。其机制是与核糖体结合，从而破坏合成蛋白，导致细胞膜损伤和细胞死亡。由于妥布霉素具有良好的水溶性，低成本和广泛的抗菌谱特性，因此被广泛用于畜牧业。然而，过量和错误使用妥布霉素导致动物源性食品（如牛奶，鸡蛋和肉类）和环境中大量残留，这些残留物会对人类健康产生严重的副作用，如过敏，肾毒性和神经毒性。

到目前为止，已有多种传统和可靠的方法用于测定氨基糖苷类抗生素（包括妥布霉素），包括高效液相色谱（HPLC），毛细管区域电泳，酶联免疫吸附测定（ELISA）和表面等离子共振用于转移定位等。但是，这些方法存在一些缺点，如检测限高，设备昂贵，测试周期长，人员培训和样品制备复杂。因此，有必要建立一种简单，快速，准确的检测食品和环境中妥布霉素残留的检测方法。

G-四链体是一种特殊的DNA构型，通过在特定离子条件下折叠富含鸟嘌呤的核酸序列形成，并且与单价阳离子和hoogsteen氢键稳定。当G-四链体与血红素结合时，形成的G-四链体/血红素复合物具有辣根过氧化物酶活性，其能够催化H₂O₂介导的氧化还原反应以产生电化学信号和比色信号。同时，与传统的生物酶相比，G-四链体/血红素具有成本低，稳定性好，易于制备的优点，因此被广泛应用于各种生物传感器的开发中。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于双重链置换和三向DNA结构检测妥布霉素的比色方法，其具有高灵敏、高特异性、低成本、结果可视化等优点。

本发明的技术方案，本发明具体包括非完全互补双链设计和三向DNA连接结构的序列设计；Bsm DNA聚合酶通过强链置换反应合成完全互补的双链，Nt.BstNBI切刻内切酶切割双链上的识别位点，产生大量的报告探针；三向DNA结构与报告探针杂交，触发λ核酸外切酶辅助的环路扩增，刺激报告探针再生并置换出大量S1（含有G-四链体形成序列）；G-四链体/血红素复合物催化ABTS^2- / H₂O₂系统产生显色反应并通过UV-vis分光光度计测量吸光度，如图1所示。