[发明专利]一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法

说明书

本发明公开了一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合DNA杂交技术，构建以DNA杂交为基础的磁传感器，该方法首先根据致病菌的基因序列设计并合成与该基因互补的正向探针和反向探针，将正向探针偶联在纳米磁颗粒表面，用于特异性地富集待测致病菌DNA片段，然后加入生物素标记的反向探针，形成DNA互补链，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(ALP)，形成“磁纳米颗粒‑DNA杂交双链‑ALP”的夹心结构，该夹心结构的含量与待测致病菌中的DNA含量成正相关。该方法不需要DNA扩增，提高了DNA分子检测的效率，拓宽了基于超顺纳米磁颗粒的低场核磁共振传感器的应用范围，进而为食源性致病菌的检测提供一种有力的工具。

技术领域

本发明属于分析化学和食品安全领域，具体而言，本发明涉及一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法。

背景技术

食源性致病菌是导致食品安全问题的一个重要的因素，快速、高灵敏检测食源性致病菌对保障食品安全具有重要的意义。目前主要的检测方法有微生物培养法、免疫检测方法和PCR分子诊断方法。微生物培养法需要较长的培养时间，操作步骤繁琐，不适合现场、快速检测。免疫检测方法，主要包括酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析试纸条法。酶联免疫吸附法需要多步操作，检测时间较长，同时灵敏度也不能满足样品中痕量的食源性致病菌检测的需要，而胶体金免疫层析试纸条的方法，具有检测速度快，一步操作即可完成的优势，但其灵敏度比酶联免疫吸附法还低，无法实现低浓度的食源性致病菌的检测。PCR分子诊断方法是检测致病菌的金标准，但其需要昂贵的设备和洁净的环境，并且需要多轮的扩增，不适合现场分析。

因为一般生物或者食品样品中磁信号背景极低，因此基于弛豫时间信号改变的低场核磁共振生物传感器具有样品前处理简单的优点，其在食品安全、临床诊断和环境监测等领域得到越来越广泛的应用。目前，磁弛豫时间传感器主要包括：(1)基于磁颗粒状态改变的横向弛豫时间(T₂)生物传感器：磁颗粒表面偶联有抗体或适配体之类的特异性生物识别分子，在均匀磁场中，通过特异性结合，目标物会诱导磁颗粒状态的变化(分散或聚集)，同时会改变磁场的均匀度进而引起周围水分子质子T₂的改变；(2)将磁分离和磁弛豫时间相结合的磁弛豫时间免疫传感器：基于粒径大小不同的磁颗粒在同一磁场中分离速度的显著差异，从而将免疫磁富集和磁弛豫时间免疫分析方法结合起来，实现磁分离和磁信号检测一步完成。这些磁弛豫时间传感器都是基于超顺纳米磁颗粒产生信号，而当检测复杂样品时会造成磁颗粒自身的聚集或非特异性吸附，产生假阳性结果；另外，制备稳定性好的超顺纳米小磁颗粒的工艺比较复杂，成本也比较高，重复和稳定性都有待进一步提高，因此需要开发稳定性更好、成本更低、可操作性更强的磁信号探针。

相比于超顺纳米磁颗粒，将顺磁离子作为磁信号探针有着独特的优势：(a)稳定性好、成本低，相比传统的纳米磁颗粒，顺磁离子水溶液稳定性更好，成本更低；(b)纳米磁颗粒在复杂基质中容易发生聚集，造成分析结果不稳定，但顺磁离子则可以很好地避免这个问题，因此抗干扰能力更强；(c)很多类型的氧化还原反应可以实现顺磁离子价态的转换，实现磁信号(T₂)的变化，进而可以检测一系列的目标物，并且能够同时实现生化分析和免疫分析。可见，此类传感器将在众多领域发挥越来越重要的作用。Fe(III)/Fe(II)，Cu(II)/Cu(I)都是常见的顺磁离子，其不同价态的转变都可以导致横向弛豫时间(T₂)或者纵向弛豫时间(T₁)的改变，但Fe(III)/Fe(II)，Cu(II)/Cu(I)这两组顺磁离子价态的改变导致的T₂信号变化有限，因为这两组不同价态的顺磁离子本身都有磁信号，只是磁信号由弱变强，因此该磁信号的改变不显著，很难用于复杂食品样品中痕量食源性致病菌的分析。