[发明专利]基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源基因的检测方法及试剂盒

说明书

本发明属于转基因玉米相关成分真伪鉴定方法，具体地说是利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测转基因玉米外源抗除草剂bar基因、pat基因的方法。该方法根据转基因玉米外源抗除草剂bar基因、pat基因设计了特异性的LAMP引物，并提供了配套的试剂盒、检测方法和用途。本发明结合可视化报告方式，以中性红pH指示剂进行比色检测可实现一步可视化的比色检测。本发明在等温条件下进行，无需精密的变温设备，便捷、准确、分辨率高，检测过程无需开盖操作，适合于现场快速检测。

技术领域

本发明属于转基因相关成分检测鉴定方法，具体地说是利用LAMP技术分别检测转基因抗除草剂外源bar基因、pat基因的方法。

背景技术

自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术(genetically modifiedorganisms，GMOs)发展十分迅速，并已应用于农业、医药、工业等多个领域。1996年转基因作物开始商业化种植，全球转基因作物的种植面积逐年增加。然而，转基因作物对于人体健康、生态环境等的风险一直存在争议，为了规范管理转基因作物、保障消费者的知情权，世界各国都在努力制定相应的法律和法规,以加强对转基因作物及其产品的管理。因此，亟需建立一套快速、简便、准确的快速检测方法，建立转基因生物安全检测技术体系，以满足相关检验机构的日常现场快速检测的需求。

随着分子生物学技术的发展，许多以DNA分子为目标的检测方法已被广泛应用。目前检测转基因作物的方法主要有定性PCR法、实时荧光定量PCR法(RT-PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等。定性PCR技术操作繁琐，实时荧光定量PCR法检测成本高，且两者都难以实现现场检测。环介导等温扩增技术(LAMP)技术是一种在等温条件下进行的核酸体外扩增技术，在较短的反应时间内表现出较高的灵敏度和扩增效率，目前LAMP方法已经成为最常用的等温扩增手段之一。但目前常用的LAMP反应产物分析手段为实时荧光报告的方式、终点荧光/浊度报告法，需配备专用检测设备，同样难以适用于现场快速筛查。近年来，可视化分析方法在快速现场检测中展现优势。可视化染料比色分析既提高了肉眼的识别率，操作又更为简单，在保证其准确率的情况下，可直接用于快速的现场检测，有报导利用pH指示剂中性红(neutral red,N-red)作为一步可视化的报告方法，可使LAMP技术在现场快速检测领域具有更大的优势。

发明内容

本发明的目的是提供基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因、pat基因的LAMP引物、试剂盒、检测方法和用途。

本发明转基因抗除草剂外源bar基因检测的特异性LAMP引物是根据转基因抗除草剂外源bar基因DNA序列的保守区域设计的。从GeneBank中查找到转基因抗除草剂外源bar基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：

外引物barB3：AGGTGGACGGCGAGGT

外引物barF3：TGCATGCGCACGCTC

内引物barBIP：TGGCGGGGGGAGACGTACAGGGTCCCTGGAAGGCA

内引物barFIP：TGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGTTGGGCAGCCCGATG

环引物barLB：CGGTTGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCG

环引物barLF：GGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGT。

本发明转基因抗除草剂外源pat基因设计的特异性LAMP引物是根据转基因抗除草剂外源pat基因的序列设计的。从GeneBank中查找到转基因Bt176中外源cry1Ab基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：

外引物patB3：GGTAACTGGCCTAACTGGC

外引物patF3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG