[发明专利]一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法

说明书

本发明公开了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，以及专用的RPA引物对(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)、试剂盒。本发明根据鸭乙型肝炎病毒的基因序列设计特异性引物，进一步优化建立了用于快速准确进行鸭乙型肝炎病毒检测的重组酶聚合酶等温扩增方法。该方法可特异性地检测出鸭乙型肝炎病毒，其最低检出模板量为146pg，灵敏度与传统PCR相当。由于整个基因扩增只需一个温度，不需要特殊的仪器设备，操作更简单、快速，适用于生产中鸭乙型肝炎病毒的现场快速检测。

技术领域

本发明涉及一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的一个主要公共卫生问题。由于HBV宿主范围狭窄，有明显嗜肝性和种属特异性，人工培养HBV尚未成功，建立较理想的HBV感染细胞及动物模型也很困难，已成为限制抗HBV药物开发和评价的主要障碍。而鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与HBV同属嗜肝DNA病毒科，两者在形态结构、核酸组成、生物学特性、发病机理和相对嗜肝性等方面有众多相似之处，同时鸭对DHBV易感，且来源丰富，价格低廉，易于饲养，常被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的理想动物模型。因此，及时掌握鸭群乙型肝炎的流行现状及感染情况是十分必要的。

目前对DHBV DNA进行检测的方法较多，其中Southern blot杂交、斑点杂交等方法灵敏性较低、稳定性差、操作复杂，已不常用。聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR等技术应用广泛，但这些技术需依赖于控温准确的热循环仪器，限制了其在临床现场检测中的应用。而核酸恒温扩增技术不需反复热变性，无需特殊仪器，反应速度更快，适合现场快速检测，在生命科学研究领域已被广泛应用。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型恒温扩增技术，它具有操作简单、特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点，并且可以在非实验室的条件下完成核酸扩增。利用RPA技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列，目前在病原学检测领域应用特别广泛。但迄今尚未见采用RPA技术检测鸭乙型肝炎病毒的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，以及所用到的特异性引物、检测试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测鸭乙型肝炎病毒的RPA引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；其所特异性扩增的遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

上游引物F：5’-GCCTTAGCCAATGTGTATGA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5’-GGTGGAACAGGAGTAGTAGT-3’(SEQ ID NO.2)。

上述RPA引物对在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用。

遗传标记物在制备检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒中的应用，所述遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种检测鸭乙型肝炎病毒的试剂盒，包括上述RPA引物对，以及检测所必须的试剂，如Rehydration Buffer、ddH₂O和MgAc。

一种鸭乙型肝炎病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测物的基因组DNA(参照EasyPure@ViralDNA/RNA Kit试剂盒说明书)，利用RPA引物对进行重组聚合酶等温扩增，所述RPA引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其所特异性扩增的遗传标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；