[发明专利]核酸的合成方法

说明书

本发明提供了一种核酸的合成方法。该合成方法包括：将待合成的核酸按序列顺序拆分成多组片段进行分别合成，得到多组核酸片段，每组核酸片段包含2～5个碱基；采用固相合成的方式将各核酸片段按序列顺序进行连接，从而得到核酸。本申请创造性地提出了多碱基的短片段偶联代替单碱基偶联的新的合成策略，先合成多个含2‑5个碱基的短片段，再使用固相合成法进行顺序拼接。多个片段可以同时平行合成，且不受固相载体载量的限制，可方便地得到大量高纯度的短片段。采用固相方式进行拼接，将原来的连接步骤缩减了至少1/2，大大缩短了反应时间，提高了反应效率和总收率，同时还避免了传统合成中N‑1非目的片段的产生，提高了产品的纯度。

技术领域

本发明涉及核酸合成领域，具体而言，涉及一种核酸的合成方法。

背景技术

目前，核酸的固相合成是采用三价磷化学，通过四步循环反应，每次连接一个碱基进行合成。此方法的优点是快速，高效。但是同时存在偶联不完全的片段存在，即存在N-1问题。给后续的纯化带来很大的麻烦。以Spinraza为例，Spinraza的传统的合成方式也是使用固相载体一次连接一个碱基，需要18步连接反应才能够实现。因此，不仅合成步骤较长，并且合成过程中存在N-1等短片段，纯化困难。

因此，仍需要提供一种相对快速高效的核酸合成方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种核酸的合成方法，以解决现有方法合成步骤长，效率低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种核酸的合成方法，该合成方法包括：将待合成的核酸按序列顺序拆分成多组片段进行分别合成，得到多组核酸片段，每组核酸片段包含2～5个碱基；采用固相合成的方式将各核酸片段按序列顺序进行连接，从而得到核酸。

进一步地，将待合成的核酸按从3’端到5’端的顺序拆分成多组片段进行分别合成。

进一步地，将待合成的核酸按从5’端到3’端的顺序拆分成多组片段进行分别合成。

进一步地，每组核酸片段包含2～3个碱基，优选包含3个碱基。

进一步地，多组核酸片段采用液相合成的方式合成。

进一步地，液相合成通过脱保护基反应、偶联反应及氧化反应三个步骤循环的方式，每次连接一个碱基进行合成。

进一步地，固相合成通过脱保护基反应、偶联反应、氧化反应以及覆盖自由羟基反应四个步骤循环的方式，每次连接一个核酸片段进行合成。

进一步地，采用固相合成的方式将各核酸片段按序列顺序进行连接，从而得到核酸包括：步骤A，对固相载体表面的保护基进行脱保护基反应，露出羟基；步骤B，将带有保护基的核酸片段与羟基进行偶联反应，得到偶联物；步骤C，对偶联物进行氧化反应，得到氧化产物；步骤D，对氧化产物进行覆盖自由羟基反应，得到连接有核酸片段的固相载体；循环执行步骤A到步骤D，得到核酸；其中，按照序列顺序，每次循环连接一个核酸片段；优选地，采用脱保护溶液进行脱保护基反应，脱保护溶液为1～5w/v％的二氯乙酸的甲苯溶液、二氯乙酸的二氯甲烷溶液或二氯乙酸的甲醇溶液；优选地，将核酸片段溶于乙腈、二氯甲烷或四氢呋喃中进行偶联反应；优选地，采用((E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二硫噻唑-5-基)甲脒或氢化黄原素进行氧化反应；优选地，采用乙酸酐和N-甲基咪唑进行覆盖自由羟基反应；优选地，在步骤A到步骤D的每一步骤后，还包括可选的洗脱纯化步骤，更优选，洗脱纯化步骤采用乙腈、二氯甲烷或四氢呋喃进行。

进一步地，保护基为DMTr、MMTr或Tr。

进一步地，核酸片段与羟基的摩尔比为1：1～10：1。

进一步地，核酸为长度为8～30nt的寡核苷酸；优选核酸为15～30nt的反义寡核苷酸，更优选核酸为Spinraza；