[发明专利]一种诱导汗腺功能性修复的方法

权利要求书

1.一种诱导汗腺功能性修复的方法，其特征在于，包括以下步骤：

设计EDA启动子序列，构建pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒；

获取pHAGE TRE dCas9-VP64质粒；

利用慢病毒分别对pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒和pHAGE TRE dCas9-VP64质粒进行包装；

获取基底层表皮角质细胞；

利用慢病毒包装的pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒及慢病毒包装的pHAGE-TRE-dCas9-VP64质粒依次转染所述表皮角质细胞，并进行EDA基因鉴定，获得稳定过表达EDA基因的细胞株；

利用具有强力霉素的汗腺培养基培养所述细胞株，诱导其体外重编程为汗腺样细胞；

在基质胶环境下，利用具有强力霉素的汗腺培养基培养所述汗腺样细胞，诱导形成类汗腺原基；

将所述类汗腺原基移植至汗腺丧失区，并利用强力霉素诱导形成再生汗腺。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子序列为：

F-5′-ACCCGTTCCTGCGCGACAG-3′，

R-5′-TCATTCCCTCGGCGGGCCGA-3′。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有强力霉素的培养基，包括DMEM/F12、Gltamax、Hepes、B27、EGF和bFGF。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gltamax、Hepes和B27的体积分数均为1％，EGF的浓度为50ng/mL，bFGF的浓度为20ng/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在基质胶环境下，利用具有强力霉素的培养基，包括：

将浓度为10mg/mL下基质胶与密度为2.5×10⁵/mL的汗腺样细胞悬液等体积混匀后铺板，待基质胶凝固后加入含强力霉素的汗腺培养基进行培养，得到类汗腺原基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述汗腺培养基中强力霉素的浓度为10ug/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用慢病毒包装的pGLV-H1-GFP-EDAsgRNA质粒及慢病毒包装的pHAGE-TRE-dCas9-VP64质粒依次转染所述表皮角质细胞，并进行EDA基因鉴定，获得稳定过表达EDA基因的细胞株，包括：

利用聚凝胺对所述表皮角质细胞进行预处理；

采用Lipo2000作为转染试剂，利用pMD2G和PsPAX作为包装载体，将pGLV-H1-GFP-EDAsgRNA质粒与包装载体混合后，转入人肾上皮细胞系239T细胞中进行第一次病毒包装，收集第一次包装后的病毒液，将病毒液转入预处理后的表皮角质细胞中进行第一次转染，将第一次转染后的表皮角质细胞换液至含HKGS的EpiLife培养基中进行传代培养，后通过细胞流式分选，获得GFP表达强阳性的细胞亚群；

利用聚凝胺对所述GFP表达强阳性的细胞亚群进行预处理；

采用Lipo2000作为转染试剂，利用pMD2G和PsPAX作为包装载体，将pHAGE-TRE-dCas9-VP64质粒与包装载体混合后，转入人肾上皮细胞系293T细胞中进行第二次病毒包装，然后收集第二次包装后的病毒液，将病毒液转入所述GFP表达强阳性的细胞亚群进行第二转染；并通过抗生素G418进行阳性细胞筛选；

将G418筛选阳性的细胞亚群进行EDA基因鉴定，获得稳定过表达EDA基因的细胞株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述预处理后的表皮角质细胞的细胞融合度为40％，所述预处理后的GFP表达强阳性的细胞亚群的细胞融合度为40％。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述包装载体中，pMD2G和PsPAX的质量比为1：3。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获取基底层表皮角质细胞，包括：

取新鲜包皮组织，利用医用酒精进行消毒，将消毒后的包皮组织除去皮下部分，并用含有10％青霉素/链霉素混合液的PBS反复冲洗，随后剪成1cm×1cm×2mm大小组织块，加入0.2％dispase II溶液，浸没组织，4℃消化过夜，再将表皮层与真皮层分离，剪碎，加入0.25％的胰蛋白酶/EDTA，37℃消化10min，加入含10％胎牛血清的DMEM终止消化，100目滤网过滤细胞悬液，收集滤过的细胞悬液于离心管中，1000rmp，离心5min，弃去上清液，加入含1％HKGS的EpiLife培养基重悬细胞，在37℃、5％CO2的环境下进行孵育过夜，再更换培养基进行传代培养，即得到基底层表皮角质细胞。