[发明专利]一种诱导汗腺功能性修复的方法

说明书

本发明提供了一种诱导汗腺功能性修复的方法，包括：设计EDA启动子序列，构建pGLV‑H1‑GFP‑EDA sgRNA质粒；获取pHAGE‑TRE‑dCas9‑VP64质粒；利用慢病毒分别对上述两种质粒进行包装；利用上述两种慢病毒包装的质粒依次转染获取的基底层表皮角质细胞，获得稳定过表达EDA基因的细胞株；利用含强力霉素的培养基培养细胞株为汗腺样细胞；在基质胶环境下，利用含强力霉素的培养基培养汗腺样细胞形成类汗腺原基；将类汗腺原基移植至汗腺丧失区，利用强力霉素诱导形成再生汗腺。本发明应用CRISPR/dCas9技术在基因水平上对基底层表皮角质细胞进行编辑修饰，提高了汗腺重编程的效率；同时以基质胶为支架联合汗腺特异性培养基，诱导表皮角质细胞形成类汗腺原基，促进了体内汗腺从组织结构到生理功能的修复。

技术领域

本发明涉及汗腺再生研究领域，特别是涉及一种诱导汗腺功能性修复的方法。

背景技术

汗腺作为皮肤的重要附属器官，在物质代谢、体温调节以及维持机体内环境稳态等方面都具有举足轻重的作用。严重烧/创伤引起的大面积体表皮肤软组织缺损，其后期主要表现为增生性瘢痕修复，失去皮肤的正常组织学结构及生理功能。特别是大量瘢痕组织的形成导致汗腺结构被破坏且无法再生，机体由此失去了通过排汗来调控体温这一基本功能，这不仅给患者的生理与心理带来巨大的负担，而且严重影响了患者的生活质量。因此，汗腺再生的研究具有十分显著的现实意义和社会意义。

近年来，基因编辑技术发展十分迅速，在众多的基因编辑技术中，以CRISPR/dCas9技术为代表的第三代基因编辑技术由于其具有安全性好、效率高、可以精准定位、操作简便易行等优点，被认为是针对人类体细胞进行基因编辑的有效手段之一。EDA基因属于肿瘤坏死因子家族，其在皮肤附属器(尤其是汗腺)形成中起重要作用。EDA主要通过EDA受体激活核因子-κB调节汗腺成熟。因此，重编程汗腺细胞过程中，EDA基因可作为一个潜在的干预靶点。基质胶是一种具有生物学活性的三维培养基质，能够为细胞提供保护和支撑，使其在立体环境中增殖。相较于传统的二维培养体系，基质胶所提供的立体构架更接近于正常组织的三维空间基质环境，使得细胞在体外增殖、分化过程中形成的类器官体(organoid)在形态上接近其来源组织，更符合机体组织器官的发生、发展过程。

研究表明，位于基底层的表皮角质细胞(Human Epidermal Keratinocytes,HEK)具有干细胞的特征。这些细胞不但表达干细胞的表面标记，如β1和α6integrin、CK19、CK15及Sox9等，还可以通过不对称分裂完成自我更新，直接参与并影响创面的修复进程。而且有学者指出，表皮基底层角质细胞较其他组织来源的体细胞在发育进程上更为原始，具有强大的可塑性。它们一方面通过调节自我更新与分化之间的平衡来维持表皮组织的结构完整，另一方面通过转分化形成皮肤内其他谱系来源的细胞类型，参与皮肤的重建与再生。结合表皮与汗腺在发育上的同源性，毋容置疑，表皮基底层角质细胞可以作为修复种子细胞之一，用于汗腺再生相关的基础与临床研究。

但是，传统的诱导表皮角质细胞转分化为汗腺的技术体系有重编程效率低、转化细胞适应能力差，以及形成的组织替代物无功能等局限性。

发明内容

鉴于上述问题，提出了本发明实施例以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种诱导汗腺功能性修复的方法。

为了解决上述问题，本发明实施例公开了一种诱导汗腺功能性修复的方法，其中，包括以下步骤：

设计EDA启动子序列，构建pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒；

获取pHAGE TRE dCas9-VP64质粒；

利用慢病毒分别对pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒和pHAGE-TRE-dCas9-VP64质粒进行包装；

获取基底层表皮角质细胞；