[发明专利]蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法及其应用

权利要求书

1.一种蚓酶多肽抑菌营养液的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：对蚯蚓、动物脏器进行预处理；

步骤二：对步骤一中预处理后的蚯蚓进行分级提取，提取得到三种蚯蚓蛋白酶酶原，分别为碱性蛋白酶酶原A、中性蛋白酶酶原B和酸性蛋白酶酶原C；

步骤三：将步骤二制得的三种酶原分别进行激活，制备得到蚯蚓碱性蛋白酶、蚯蚓中性蛋白酶和蚯蚓酸性蛋白酶；

步骤四：将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合后，匀浆并加入纯水，加入步骤三中制得的蚯蚓碱性蛋白酶，酶解后过滤，滤液作为酶促水解液①备用；

将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合后，匀浆并加入纯水，加入步骤三中制得的蚯蚓中性蛋白酶，酶解后过滤，滤液作为酶促水解液②备用；

将步骤一中预处理后的蚯蚓和动物脏器混合后，匀浆并加入纯水，加入步骤三中制得的蚯蚓酸性蛋白酶，酶解后过滤，滤液作为酶促水解液③备用；

步骤五：取步骤四中制得的三种酶促水解液①②③混合，过滤除去沉淀，得蚓酶多肽抑菌营养液成品；

所述步骤二中提取蚯蚓蛋白酶酶原的步骤包括：

S1：将预处理后的蚯蚓用闪式提取器匀浆，提取，过滤得提取液和沉淀；

S2：将步骤S1中所得提取液加入硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到72-78％进行盐析，过滤得到滤液和沉淀；

S3：将步骤S2中所得沉淀进行回溶、盐析、分离，得到沉淀和清液；

S4：将步骤S3中所得沉淀进行回溶、结晶、分离并将晶体干燥，得到碱性蛋白酶酶原A；

将步骤S3中所得清液纳滤除盐后加入乙醇使其沉淀，分离，得到沉淀和清液；

S5：将步骤S4中所得沉淀回溶、结晶、分离并将晶体干燥，得到中性蛋白酶酶原B；将步骤S4中所得清液絮凝后分离，得到沉淀和清液；

S6：将步骤S5中所得沉淀回溶、结晶、分离并将晶体干燥，得到酸性蛋白酶酶原C；

将步骤S1中所得沉淀并入蚓酶多肽原料，与步骤一中预处理后的蚯蚓一同作为备料；

向步骤S2中所得滤液加入硫酸铵使溶液的硫酸铵饱和度达到82-88％进行盐析后过滤，将沉淀用于制备蚓激酶原料；

将步骤S5中所得清液用于制备弹性蛋白酶的原料；

所述步骤三具体包括：

制备蚯蚓碱性蛋白酶：将步骤一获得的碱性蛋白酶酶原A与纯水按照质量比1.0:1.0-3.0的比例混合，搅拌溶解，用1.0-2.0mol/L的NaOH调pH值7.5-8.5，搅拌下加入硫酸铵至(NH4)₂SO₄饱和度为75％-85％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在25-35℃环境结晶8-12h，过滤得蛋白酶A结晶，干燥；

制备蚯蚓中性蛋白酶：将步骤一获得的中性蛋白酶酶原B与纯水按照质量比1.0:1.5-4.5的比例混合，搅拌溶解，用1.0-2.0mol/L的NaOH调pH值5.5-7.5，搅拌下加入硫酸铵至(NH4)₂SO₄饱和度为55％-75％，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，在25-35℃环境结晶8-12h，过滤得蛋白酶B结晶，干燥；

制备蚯蚓酸性蛋白酶：将步骤一获得的酸性蛋白酶酶原C放入夹层反应釜，按照酸性蛋白酶酶原C与纯水按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，搅拌溶解，用2.0-4.0mol/L的HCl调pH值1.0-3.0，加热至40-50℃，加入溶液总质量0.1‰的结晶牛胰蛋白酶作为激活剂，保温3-7h，过滤得滤液，滤液经减压浓缩至原体积的1/3-1/4，进行低温喷雾干燥，喷雾干燥器进风口温度控制在120-150℃，出口温度控制在30-50℃，得蛋白酶C干粉；

所述步骤四具体包括：

制备蚯蚓碱性蛋白酶酶促水解液：将步骤一中预处理后的蚯蚓与缓化后的动物脏器按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器的匀浆与纯水按照质量比1:0.5-1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓碱性蛋白酶，蚯蚓碱性蛋白酶与底物的质量比为1:500-1000，用1.0-3.0mol/L的NaOH调pH至8.0-10.0，升温至38-45℃，间隔搅拌，酶解10-20h，过滤，得酶促水解液①；

制备蚯蚓中性蛋白酶酶促水解液：将步骤一中预处理后的蚯蚓与缓化后的动物脏器按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器的匀浆与纯水按照质量比1:0.5-1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓中性蛋白酶，蚯蚓中性蛋白酶与底物的质量比为1:300-800，升温至38-50℃，间隔搅拌，酶解8-14h，过滤，得酶促水解液②备用；

制备蚯蚓酸性蛋白酶酶促水解液：将步骤一中预处理后的蚯蚓与缓化后的动物脏器按照质量比1.0:0.5-2.0的比例混合，经闪式提取器匀浆，蚯蚓和动物脏器匀浆与纯水按照质量比1:0.5-1.5的比例混合，置夹层反应釜中，加入蚯蚓酸性蛋白酶，蚯蚓酸性蛋白酶与底物的质量比为1:800-1500，用2.0-4.0mol/L的HCl调pH至1.0-3.0，升温至37-45℃，间隔搅拌，酶解4-8h，过滤，得酶促水解液③备用；

所述步骤五中，取步骤四中制得的三种酶促水解液①②③，分别配置成20-40mg/mL的稀释液后，将三种酶促水解液按1-3:1-3:1-3的比例混合，搅拌均匀，过滤澄清，得蚓酶多肽抑菌营养液成品。