[发明专利]用于检测宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一组引物探针在制备用于检测宫颈癌风险的试剂盒中的应用，其特征在于，引物探针由内参引物对和内参探针、用于检测FAM19A4基因甲基化的第一引物对和第一探针、用于检测EPB41L3基因甲基化的第二引物对和第二探针以及用于检测PAX1基因甲基化的第三引物对和第三探针组成；其中，所述第一引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第三引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述内参引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的5’端均连接有荧光报告基团，且所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的荧光报告基团互不相同，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的3’端均连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA或MGB。

4.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，还包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、UNG酶、Taq DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品中的一种或多种。

5.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，包括以下使用步骤：

使用所述第一引物对、所述第一探针、所述第二引物对、所述第二探针、所述第三引物对、所述第三探针与亚硫酸盐转化后的待测DNA样本配制PCR反应体系，然后进行荧光定量PCR反应。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的条件为：49℃~51℃ UNG酶反应1min~3min；94℃~96℃变性4min~6min；94℃~96℃变性4s~6s，54℃~56℃退火延伸34s~36s并收集荧光信号，45个循环。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，还包括分析荧光定量PCR数据的步骤，所述分析荧光定量PCR数据的方法包括以下步骤：分别获取PAX1基因的Ct值、FAM19A4基因的Ct值和EPB41L3基因的Ct值与内参基因的Ct值之间的差值，根据差值判断对应基因的甲基化检测结果。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述根据差值判断对应基因的甲基化检测结果的方法为：以FAM19A4、EPB41L3和PAX1基因对应的三个△Ct值中最小的△Ct值作为判断标准，当△Ct≦9.0时结果为阳性，说明具有宫颈癌风险高；当△Ct9.0或未检出时结果为阴性，说明具有宫颈癌风险低。