[发明专利]一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的七肽及其应用

说明书

本发明公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性的七肽，七肽的缩写为CGKKFVR，分子量837.1Da，所述七肽的氨基酸序列为Cys‑Gly‑Lys‑Lys‑Phe‑Val‑Arg，所述七肽可以从黑茶黑毛尖茶中分离得到，能够实现体外降血糖的效果，可应用于保健食品、特殊医学用途配方食品与生物制药领域，改善糖尿病病人的病症，本发明还公布了所述七肽的制备方法、含有该七肽的药品组合物、含有该七肽的保健品和含有该七肽的食品。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的七肽，本发明还涉及该七肽的制备方法和应用。

背景技术

糖尿病的早期征兆往往是餐后高血糖，特别是2型糖尿病病人，餐后高血糖不仅极易诱发各种并发症，还会极大地提高糖尿病的死亡率，而α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状缘膜上皮细胞,它能将双糖,如蔗糖、麦芽糖等水解成可被小肠吸收的单糖，从而导致血糖升高，因此, 抑制α-葡萄糖苷酶能够延缓碳水化合物的消化,减少葡萄糖吸收入血, 进而控制餐后血糖浓度的升高。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型的降血糖药物，它可通过抑制小肠刷状缘细胞表面的α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成及吸收，同时增加肝脏及周围组织对胰岛素的敏感性，减少高血糖对胰腺刺激，从而起到降低血糖浓度糖及治疗糖尿病的目的。虽然,合成的α- 葡萄糖苷酶抑制药物已经上市(如阿卡波糖等),但由于它们有一定的毒副作用,因此从植物中筛选天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有广阔的前景。

发明内容

本发明旨在提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的七肽及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的七肽，所述七肽的氨基酸序列为Cys-Gly-Lys-Lys-Phe-Val-Arg，所述七肽的缩写为CGKKFVR，分子量 837.1Da。

所述七肽可以从黑茶黑毛尖茶中分离得到。具体包括如下步骤：

(1)茶蛋白提取：将黑毛尖茶叶粉碎后过20-40目筛，以料液比为1:5-40的比例混合茶粉和超纯水，于95℃加热浸提10-60min，浸提液过滤后在25℃，8000rpm/min的条件下离心20min，收集上清液，往上清液中加入饱和硫酸铵溶液(上清液:硫酸铵＝1:2-6)，在4℃静置12h，使蛋白质沉淀，然后，于4℃，6000rpm/min条件下离心 20min，取沉淀，用超纯水溶解，在室温中透析24小时，以去除硫酸铵等小分子物质，获得黑毛尖茶粗蛋白；

(2)粗蛋白的酶解：将步骤(1)制得的黑毛尖茶粗蛋白样品制成2-10mg/mL的溶液，于50℃水浴中保持10min，用浓度为2.0mol/L 的氢氧化钠调节PH至8.0，以酶/底物比(E/S)为1-5％(w/w)的比例添加胰蛋白酶，酶解时间为5-10h，酶解过程中用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠溶液调节酸碱度，使其保持在pH 8.0，酶解完成后把样品置于 95℃下加热20min使酶灭活，并于4℃，8000rpm/min离心10min，弃去沉淀，制得黑毛尖茶胰蛋白酶酶解组分，冻干备用；

(3)“酶-抑制肽”复合物的制备：取所述黑毛尖茶胰蛋白酶酶解组分配成1-5mg/mL样品溶液，将α-葡萄糖苷酶溶解在10mM pH 6.8磷酸盐缓冲液中配成10U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，再取50-300μL 所述样品溶液与100-500μL所述α-葡萄糖苷酶溶液混合，于37℃下，摇床培养10-60min，使酶与抑制剂样品充分结合；

(4)未与酶结合成分的去除：培养结束后，把步骤(3)制得的混合物加入截留分子量为30kDa的超滤离心管中，并于常温下， 10000rpm/min离心25min，去除样品中未与酶结合的成分，用200μL 磷酸缓冲洗截留后的滤液3次，并于常温下，5000rpm/min离心5min；