[发明专利]一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA‑34的基因，涉及基因工程技术领域。本发明所述基因基于DNA立体镊子结构快速原位检测microRNA，能够实现在活细胞内的迅速检测，避免了microRNA提取，逆转录以及PCR等一系列的操作。同时针对microRNA针对疾病诊断特异性较差的现状，原位检测能够很好的实现对microRNA表达异常的细胞的检测，从而明确发生疾病的细胞及组织来源，能够极大地增强microRNA检测的临床意义。在本发明实施例中，对梯度稀释待测microRNA‑34进行检测，检测限达到1.499nm，灵敏度高；同时相较于其他序列相似的microRNA，表现出高度特异性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用。

背景技术

MicroRNA作为一类内源性、非编码的RNA分子，其在生命活动的许多过程中起着重要的调节作用，尤其是与包括癌症在内的众多疾病的发生、发展密切相关。MicroRNA异常表达与肿瘤等疾病的密切关系促使其可以作为诊断和预测癌症的生物标志物。然而，由于microRNA本身含量低、易于降解、尺寸小、序列相似以及在肿瘤中广泛的异常表达等特点，使其难以通过简单方法直接检测，因而急需发展高灵敏度、高特异性的原位检测方法。目前常用的microRNA检测方法包括northern blot，实时定量PCR以及原位杂交等，然而这几种方法对microRNA检测过程中均无法兼顾高灵敏度、高特异性及原位检测这三个重要因素，并且其操作过程繁琐，条件要求苛刻，需要有经验的人员进行操作，从而限制了其应用范围。然而，在临床及科研中，单一的microRNA不能发挥诊断作用的重要原因之一就是不能判定其细胞来源，而实时的高灵敏的microRNA原位检测将可以弥补这一缺陷。因此，实现microRNA在活细胞内的原位检测将是推动其在临床领域应用的一大机遇。

近几年来，对microRNA和mRNA的胞内检测逐渐开始崭露头角。前期有研究利用上转发光金纳米粒子修饰的DNA四面体结构实现了对活细胞内的microRNA的定量检测，或是利用石墨烯结合DNA荧光探针实现了对活细胞内microRNA的原位检测。然而，目前核酸分子的胞内检测大多还需辅以各种纳米材料作为载体实现，其细胞毒性，体内代谢效率等问题难以避免。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种活细胞原位检测microRNA-34的基因及其制备方法和应用，利用生物相容性极高的DNA纳米结构进行胞内检测，有效减少对细胞本身活性的影响，能够实现在活细胞内的迅速检测，避免了microRNA提取，逆转录以及PCR等一系列的操作，能够简单有效的快速实现对microRNA的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种活细胞原位检测microRNA-34的基因，所述基因由P1、P2、P3、P4、P5和P6组装成立体镊子结构，所述立体镊子结构包括5条边和4个面；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述P5的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

在所述立体镊子结构中，所述P1和P2的结合部分形成固定边1；P1和P3的结合部分连接P1和P5的结合部分形成边2；P2和P3的结合部分连接P2和P5的结合部分形成边3；P2和P4的结合部分连接P2和P6的结合部分形成边4；P1和P4的结合部分连接P1和P6的结合部分形成边5；所述固定边1、边2和边5形成面1，所述固定边1、边3和边4形成面2，所述面1和面2以所述固定边1为轴开合；在所述边2和边3之间包括microRNA的结合部。

优选的，在所述立体镊子结构中，还包括荧光基团和荧光淬灭基团。

优选的，在所述P5和P6的一端分别包含有荧光基团和荧光淬灭基团。