[发明专利]一种通过基因编辑技术提高番茄中番茄红素含量的方法

说明书

本发明公开了一种基因编辑技术提高番茄中番茄红素含量的方法，包括以下步骤：分别构建Lcyb1、Lcyb2、CycB和LcyE基因的靶序列T₁～T₄，然后通过靶序列分别构建其对应的T₁sgRNA～T₄sgRNA表达盒；将T1sgRNA～T4sgRNA表达盒与crispr/cas9表达载体进行组装，得到重组质粒；利用农杆菌侵染法将重组质粒转化到番茄中，得到番茄新材料，因为新番茄材料中与番茄红素环化酶合成相关基因会存在一个或多个基因的突变，从而抑制番茄红素环化酶的合成，使得新番茄材料的番茄红素含量提高；本发明的方法可实现对一个或多个番茄红素环化酶基因进行编辑，且通过遗传分离可筛选出不含外源载体序列的番茄材料，不存在转基因风险。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过基因编辑技术提高番茄中番茄红素含量的方法。

背景技术

番茄红素是成熟番茄的主要色素，是一种不含氧的类胡萝卜素，也是目前在自然界的植物中被发现的最强抗氧化剂之一。科学证明，人体内的单线态氧和氧自由基是侵害人体自身免疫系统的罪魁祸首，番茄红素清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E，其淬灭单线态氧速率常数是维生素E的100倍。由于其优越的生理功能，它不仅可以有效的防治因衰老，免疫力下降引起的各种疾病，还具有预防心血管疾病、动脉硬化等作用，进一步而言，其对抗癌抑癌也有一定的功效，因此，它受到世界各国专家的关注。

番茄红素最早是在番茄中发现，因而取名番茄红素，提高番茄中番茄红素的产量无论是番茄营养组份的提高还是用于番茄红素的提取都有很大作用。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器。科学家掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除，这就是crispr/cas9基因编辑系统，是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

番茄中番茄红素的含量主要跟番茄红素环化酶有关，而番茄环化酶的合成跟4条染色体上的4个基因相关，分别为Lcyb1(4号染色体)、Lcyb2(10号染色体)、CycB(6号染色体)和LcyE(12号染色体)。但是目前并未有通过调整上述基因提高番茄中番茄红素的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过crispr/cas9基因编辑技术提高番茄中番茄红素含量的方法，其可通过改变与番茄红素环化酶合成相关的一个或多个基因，达到抑制番茄红素环化酶的合成，从而提高番茄红素含量的目的。

本发明这种通过crispr/cas9基因编辑技术提高番茄中番茄红素含量的方法，包括以下步骤:

1)分别构建Lcyb1、Lcyb2、CycB和LcyE基因的靶序列T₁～T₄，然后通过靶序列分别构建其对应的T₁sgRNA～T₄ sgRNA表达盒；

2)将步骤1)中的T1sgRNA～T4sgRNA表达盒与crispr/cas9表达载体进行组装，得到重组质粒；

3)利用农杆菌侵染法将步骤2)中的重组质粒转化到番茄中，得到番茄新材料，因为新番茄材料中与番茄红素环化酶合成相关基因会存在一个或多个基因的突变，从而抑制番茄红素环化酶的合成，使得新番茄材料的番茄红素含量高；

其中：T₁～T₄的核苷酸序列如序列1～4所示。