[发明专利]基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法

权利要求书

1.一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括盒体以及置于盒体内的：

（1）包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条；

（2）双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由巯基标记的单链扩增引发探针与抗单增李斯特菌多克隆抗体包被胶体金得到；

（3）DNA扩增探针；包括3’端具有生物素标记的第一发卡DNA和5’端具有生物素标记的第二发卡DNA；所述第一发卡DNA包括5’端突出的第一识别序列和茎环结构，所述第二发卡DNA包括3’端突出的第二识别序列和茎环结构，所述第一发卡DNA的茎部配对部分与第二发卡DNA的茎部配对部分的序列相同，所述第一发卡DNA的第一识别序列与第二发卡DNA的环部序列完全互补，所述第二发卡DNA的第二识别序列与第一发卡DNA的环部序列完全互补，并且，所述第一发卡DNA的5’端碱基序列与单链扩增引发探针中至少一部分互补配对；

（4）反应缓冲液；所述反应缓冲液为含有链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；

（5）单增李斯特菌标准品；

（6）微孔洗涤液；

（7）化学发光底物液；

所述单链扩增引发探针的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述第一发卡DNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述第二发卡DNA的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条由包括以下步骤的方法制得：抗单增李斯特菌单克隆抗体经碳酸盐缓冲液包被到聚苯乙烯微孔条上，包被完成洗涤后抽真空封装。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，该方法还包括：在包被完成后经惰性蛋白封闭孔；所述惰性蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白和脱脂乳粉中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，抗单增李斯特菌单克隆抗体的包被浓度为0.5μg/mL-1μg/mL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述胶体金的粒径为10-20 nm；

所述双标记胶体金探针由包括以下步骤的方法得到：取新制备的胶体金使用0.08-0.12M Na₂CO₃调pH至8.5-9.5，向其中加入多克隆抗体，混匀在室温条件下震荡混匀持续20-40 min；取巯基标记的单链扩增引发探针，加入到多抗标记胶体金溶液中，混匀2-6℃静置1-3h；加入8-12% PEG20000，使其终浓度为0.8-1.2%，加入盐化缓冲液使其终浓度为0.1-0.2M，混匀后置于2-6℃陈化1-3h；加入4-6% BSA使其终浓度为0.8-1.2%，混匀后置于2-6℃封闭0.5-2h，最后进行离心：1500-2500rpm离心5-15min，除去沉淀；12000-14000rpm离心10-30min，小心除掉上清液，加入储备缓冲液吹打使沉淀溶解，重复12000-14000rpm离心，最后加入储备缓冲液溶解金探针，得到所述双标记胶体金探针。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述单链扩增引发探针的长度为30-50nt，其中巯基标记的一端具有polyA连接结构；

所述第一发卡DNA和第二发卡DNA的长度为45-60nt，所述第一识别序列和第二识别序列的长度为6-8nt；

所述第一发卡DNA的5’端碱基序列与单链扩增引发探针中除polyA连接结构以外的序列完全互补。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述反应缓冲液还含有NaCl和/或MgCl₂，所述NaCl的浓度为300-500mM，所述MgCl₂的浓度为2-8 mM；所述反应缓冲液的pH为7-8；所述链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的浓度为0.1-1.0 μg/mL；

所述微孔洗涤液为PBST洗液。