[发明专利]基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法

说明书

本发明属于食品安全检测免疫分析技术领域，涉及一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法。该试剂盒包括：(1)包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条；(2)双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由巯基标记的单链扩增引发探针与抗单增李斯特菌多克隆抗体包被胶体金得到；(3)DNA扩增探针；(4)反应缓冲液；所述反应缓冲液为含有链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；(5)单增李斯特菌标准品；(6)微孔洗涤液；(7)化学发光底物液。本发明的试剂盒采用单多抗夹心目标物的方法，与竞争检测方法相比，灵敏度更高、检测线性范围更宽、检测成本较低。

技术领域

本发明属于食品安全检测免疫分析技术领域，更具体地，涉及一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒及应用和一种基于双标记免疫胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法。

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌(单增李斯特菌)是一种具有强大致死能力的食源性致病菌，在感染者中有25％-30％的致死率。单增李斯特菌广泛存在自然环境、家禽及肉制品中，90％的感染病例是通过食用单增李斯特菌污染的饮水或食品致病的，由于其分布的广泛性及高致病性，对公众健康构成严重威胁。因此，开发简易、灵敏、高效的检测技术及试剂盒，对于食品中单增李斯特菌的快速鉴定及食品安全事件毒物的精准快速筛查具有重要意义。

基于免疫技术的检测方法是利用抗原抗体作为识别元件，从而特异性识别目标物，运用抗体识别靶细菌的技术具有条件简单、可靶向筛查、特异性强、稳定性高等特点。目前应用免疫技术的检测方法用途最广泛的是酶联免疫吸附法，该方法已经成为大部分目标物检测的“金标准”，除此之外，化学发光免疫法，荧光免疫法、免疫生物条形码法等方法都是基于免疫技术建立起来的。

双标记胶体金探针运用单多抗夹心目标物的原理，以抗原抗体识别作为分离载体，以胶体金探针上标记的大量相同单链DNA为信号输出工具，通过单抗富集目标物、多抗识别目标物与单链DNA建立数量关系，形成一个目标物对应数百条单链DNA，最后通过检测DNA的含量间接测定目标物浓度，其检测限比传统的ELISA方法高出好几个数量级，甚至检测核酸的灵敏度可以与PCR技术相当；杂交链式扩增技术是恒温扩增技术的一种，最早于2004年提出，经典杂交链式扩增最显著的特征是在于运用了两种DNA杂交形成的“发卡”状DNA，通过引发序列与发卡探针的粘性末端互补，使其杂交状态的自由能显著低于维持正常发卡结构的自由能，从而使得发卡探针解链，暴露出另一组发卡探针的识别位点，发卡相互杂交形成带缺口的DNA长链。运用这种性质结合分离手段通过标记信号(如荧光基团、辣根过氧化物酶等)可以完成对检测核酸序列的信号放大。

目前尚未发现基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒及应用和一种基于双标记免疫胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的方法。使用本发明的试剂盒可以特异地定量检测饮水及食品中单增李斯特菌菌落浓度。本发明的检测方法在原有的ELISA方法上创新了恒温扩增形成信号的级联放大，形成了灵敏度更高的检测体系。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒，该试剂盒包括盒体以及置于盒体内的：

(1)包被抗单增李斯特菌单克隆抗体的微孔条；

(2)双标记胶体金探针；所述双标记胶体金探针由巯基标记的单链扩增引发探针与抗单增李斯特菌多克隆抗体包被胶体金得到；