[发明专利]一种快速鉴定长期保存后粪便样本质量的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定粪便样本中微生物保存状态的方法，其特征在于所述方法通过实时荧光定量PCR检测样本中的参考指标保存前后变化来判断样本保存状态；

所述参考指标包括3种或3种以上菌种或菌属。

2.根据权利要求1所述的参考指标，其特征在于，所述菌种或菌属包括芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、志贺菌属、双歧杆菌属、卟啉单胞菌属、大肠杆菌、共生梭菌、具核梭杆菌、微小微单胞菌等；

优选地，所述芽孢杆菌属包含枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌等；

优选地，所述拟杆菌属包含脆弱拟杆菌、粪拟杆菌、吉氏拟杆菌、多毛拟杆菌、普通拟杆菌、埃格拟杆菌、卵圆拟杆菌、多形拟杆菌和单形拟杆菌等；

优选地，所述乳杆菌属包含德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌；

优选地，所述肠球菌属包含粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、酪黄肠球菌、坚忍肠球菌、芒地肠球菌、恶臭肠球菌、希腊肠球菌、孤立肠球菌、棉子糖肠球菌、假鸟肠球菌等；

优选地，所述志贺菌属包含痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌等；

优选地，所述双歧杆菌属包含青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌等；

优选地，所述卟啉单胞菌属包含牙龈卟啉单胞菌、非解糖卟啉单胞菌等。

3.根据权利要求1和2所述的细菌，其特征在于，针对所述细菌设计特异性引物，还包括针对所述16S rRNA V3-V4区设计的总菌检测引物；

优选地，所述引物组合物的引物长度为18-25bp，优选为20bp；

优选地，所述引物组合物的GC含量为50-60%；

优选地，所述引物组合物的Tm值为58-63℃，优选为60℃。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测体系包含细菌引物组；

优选地，所述检测体系还包括DNA、qPCR SYBRGreen Mix和dd ddH2O；

优选地，所述qPCR SYBRGreen Mix的浓度为2X；

优选地，所述DNA的添加量为1.00-1.25ng/μuL；

优选地，所述引物组的引物的浓度为0.25-1.25ng/μL。

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述PCR检测条件如下：

92℃-97℃预变性2-5min；

92℃-97℃变性 12-18s，55℃-65℃ 0.5-1.5min，40-48个循环；

优选地，所述PCR检测条件为：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃ 1min，45个循环。

6.一种快速鉴定生物微生物保存状态的试剂盒，其特征在于包含1-3所述的引物组3种或3种以上的组合和qPCR检测体系。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括扩增八联管，所述八联管分别预先分装针对不同细菌和总菌检测的PCR预混液；

优选地，所述预混液包括PCR反应液和对应的引物；

优选地，所述反应液包括Tris-HCl、硫酸铵、MgCl2和dNTPs；

优选地，所述试剂盒还包含阳性质控品和阴性质控品；

优选地，所述阳性质控品为任一细菌的基因组DNA；

优选地，所述阴性质控品为无菌水。